生物制药工艺（来自“千人”实验室的资料——愿意看的自己复制）

第一篇 生物技术制药工艺*农业院校一般都是学《发酵工程》，食品上叫发酵罐，医药上叫生物反应器。其实都是差不多。这里的生物技术制

第一篇 生物技术制药工艺

*农业院校一般都是学《发酵工程》，食品上叫发酵罐，医药上叫生物反应器。其实都是差不多。这里的生物技术制药工艺缺少对”自动控制技术“的应用对生产工艺效率提升的认识，在日益减少人工的今天稍显落后。

（工程技术只能叫专家，称自己为科学家就有点可笑了，“千人”亦是如此。）

http://202.113.13.67/course/zhiyao/edutools.php?tid=38

第一章　绪论

1.1 制药工艺学

1.2 天然提取制药技术发展

1.3 生物技术制药发展

1.4 化学合成制药技术发展

1.5 制药工业的发展

1.6 制药技术展望

第二章　微生物发酵制药工艺

2.1 微生物发酵与制药

2.2 制药微生物生长与生产关系

2.3 制药微生物菌种的建立

2.4 培养基制备

2.5 灭菌工艺

2.6 微生物发酵培养技术

2.7 发酵工艺过程的控制

2.8 抗生素生产工艺

2.9 氨基酸发酵生产工艺

2.10 维生素生产工艺 第三章 基因工程制药工艺

3.1 基因工程制药微生物表达系统

3.2 基因工程大肠杆菌的构建

3.3 基因工程菌的发酵培养与控制

3.4 重组人干扰素生产工艺

3.5 重组人生长素生产工艺

3.6 重组人胰岛素生产工艺 第四章 动物细胞培养制药工艺

4.1 制药动物细胞

4.2 哺乳动物细胞生产特征

4.3 动物细胞培养基的制备

4.4 动物细胞的培养技术

4.5 动物细胞培养过程的检测与工艺控制

4.6 重组人红细胞生成素生产工艺

4.7 单克隆抗体生产工艺 第二篇 化学制药工艺

第五章 工艺路线的设计和选择

5.1 概述

5.2 工艺路线的设计

5.3 工艺路线选择 第六章 合成工艺研究

6.1 概述

6.2 反应物的浓度和配料比

6.3 溶剂的选择和溶剂化效应

6.4 反应温度和压力

6.5 药品质量监控和工艺研究中的过渡试验 第七章 典型化学制药工艺

7.1 氯霉素的生产工艺

7.4 紫杉醇的生产工艺

7.2 头孢氨苄的生产工艺 第三篇 制药工艺共性基础

第八章 制药工艺计算

8.1 工艺设计图

8.2 物料衡算

8.3 能量衡算

8.4 工艺经济性评价 第九章 反应器设计

9.1 概述

9.2反应器的分类和结构特点

9.3 发酵罐设计与分析

9.5 其他反应器 第十章 中试放大

10.1 中试放大的概念与内容 （在食用菌工厂正好赶上中试）

10.2 中试放大研究的基本方法

10.3 中试放大的研究

1.1制药工艺学

1.1 制药工艺学

1.1.1 制药工艺学的研究对象

制药工艺学是研究药物的工业生产过程共性规律及其应用，包括制备原理、工艺路线、质量控制。 现代制药的特点是技术含量高、智力密集，发展方向是全封闭自动化、全程质量控制，大规模反应器生产和新型分离技术综合利用。

制药工艺学的工程性和实用性较强，加之药品种类繁多，生产工艺流程多样，过程复杂。即使进行仿制药物的生产，也必须要有自主知识产权的工艺。制药工艺作为把药物产品化的一种技术过程，贯穿于药物研发的整个过程，是现代医药行业的关键技术领域。制药工艺是药物产业化的桥梁与瓶颈，对工艺的研究是加速产业化的一个重要方面。因此，学习掌握制药工艺学具有重要意义。

1.1.2 制药工艺学的内容

制药工艺学是综合应用化学系列、生物系列、机械设备与工程单元操作等课程的专门知识，深化理解并掌握工艺原理，充分考虑药品的特殊性，针对生产条件、所需环境等的具体要求，研究药物制造原理、工艺路线与过程优化、中试放大、生产技术与质量控制，从而分析和解决生产过程的实际问题。从工业生产角度，改造、设计和开发药物的生产工艺，制定相应的操作规程。

制药工艺学与其他基础课、专业课联系密切，而且与生产实践紧密相关。通过设计、研究药物大规模生产的工艺条件与设备选型，从中选出最安全、最经济、最可行的工艺路线。

1.1.3 制药工艺的类别

可根据典型的药物生产过程，把制药工艺过程分为4类，生物技术制药工艺学、化学制药工艺学、中药制药工艺学和制剂工艺学。

1.1.3.1 生物技术制药工艺

以生物体和生物反应过程为基础，依赖于生物机体或细胞的生长繁殖及其代谢过程，利用工程学原理和方法对实验室所取得的药物研究成果进行开发放大，在反应器内进行生物反应合成，进而生产制造出商品化药物。细胞生长和药物生产与培养条件之间的相互关系是过程优化的理论基础。

可把生物技术制药工艺分为上下游过程。上游过程是以生物材料为核心，目的在于获得药物，包括药物研发、细胞培养工艺、放大及大规模细胞培养研究等。属于生物加工过程，如酶工程、基因工程技术、细胞培养工程、发酵工程等。下游过程是以目标药物后处理为核心，属于生物分离过程，包括药物的提取、分离、精制工艺，药物产品的检测及质量保证等。

生物技术制药工艺过程包括菌种或细胞的选育，培养基的特性与制备，无菌化操作，培养工艺的控制等。生物制药技术的学科基础包括生物化学、分子生物学、免疫学、酶学、细胞生物学、微生物学等多门学科，为药物表达和分离纯化提供方法和原理。合理设计生产工艺路线需要考虑，高效表达的载体及宿主系统，洁净室、水系统、空气等公用设施，在线实时检测的设备与生物反应器，才能有效地实现过程的控制与优化。

1.1.3.2 化学制药工艺

化学合成药物的生产工艺原理、工艺路线的设计、选择和改造。因为有易燃易爆、有毒的原料与中间体，要求最安全。成本最低，要求最经济。工艺路线最短，最简，易于组织生产，要求最便捷。三废，废水、气、渣必须处理并减少到最低，需要无污染、绿色环保工艺。化学制药涉及课程有有机化学、分析化学、物理化学、药物化学、药物合成反应，有机合成，制药设备与设计等。

化学药物合成可以分为全合成和半合成两种。全合成药物由简单的化工原料经过一系列的化学合成和物理处理过程制得；半合成药物是由已知的具有一定基本结构的天然产物经过化学结构改造和物理处理过程制得。

1.2天然提取制药技术发展

天然提取制药是指直接从天然材料中使用分离纯化等技术制备药物。现代药物最初来源于植物、动物和微生物，而且以提取分离为先导。

15～17世纪，欧洲有了金鸡纳、愈创木、药喇叭根、古柯果和可可等。

19世纪，掀起了天然提取分离药物的热潮，从植物中分离出纯的有效化学物质。从鸦片中提取出吗啡结晶；从吐根中分离得活性成份吐根碱。从金鸡纳树皮分离得到了奎宁，成为最早用于治疗疟疾的药物。从莨菪中提取了阿托品，从古柯叶取得了可卡因；从洋地黄叶子获得洋地黄甙晶体。

在20世纪50年代后，随着对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解，生产工艺技术提高，改变了原来的混合制剂，生产制备高纯度单一特异性组分的生化药物制剂，如猪牛胰岛素、前列腺酶及辅酶、激素、脂类、蛋白质和核酸及其降解产物等。生化药物品种迅速增加，已成为一类重要的药物。

由于合成工艺、技术等因素的限制，仍然有些氨基酸、维生素、核苷酸、酶、多糖、脂类等仍然不能合成生产，必须直接从天然材料中提取。还有一些手性药物和半合成药物的中间原料也必须从天然材料中直接提取。

1.3 生物技术制药发展

1.3.1 生物技术药物

生物技术是整合自然科学和工程科学，生产细胞产品和分子产品，生物技术制药就是采用生物技术生产制造药物。生物技术药物（biotechnology medicine）是利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品，包括多肽、蛋白质、酶和核酸以及具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。

20世纪80年代，生物药物（biopharmaceutical）是指用现代生物技术生产的治疗性药物，它基于重组DNA技术和杂交瘤技术生产的药物，不包括直接从天然组织、器官、血液等中提取的生化药物。随着生物技术的发展，以核酸为基础的治疗性药物也属于生物药物。

在制药领域，生物技术药物（biotechnology medicine）、生物技术产品（biotechnology product）、生物技术制品（product of pharmaceutical biotechnology）有时候也互换使用。在相关法规中，经常出现的术语是生物制品 (biologics，biologic product, 中国、美国使用)、生物医药产品（biological medicinal product，欧盟使用）。

中国生物制品规程对生物制品的定义：以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂，包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。在此基础上，分为预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断用品三类。预防用生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素；治疗用生物制品包括抗血清与抗毒素、血液制品、细胞因子与抗体；诊断用品包括细菌学试剂、免疫试剂、临床化学试剂。

1.3.2 微生物发酵制药

对微生物进行培养，生产有用化学物质的过程就是发酵过程。采用微生物发酵生产药物就是微生物发酵制药。

发酵技术大规模应用于制药是第二次世界大战期间，诞生了以抗生素为代表的次级代谢产物的工业发酵。搅拌发酵沉没法生产成功，提高了供氧和通气量，同时在菌株选育、培养和深层发酵、提取技术和设备的研究取得了突破性进展，给抗生素生产带来了革命性的变化。以后链霉素、金霉素、红霉素等抗生素出现，抗生素工业发展迅速。

抗生素生产的经验也很快应用到其他药物的发酵生产，如氨基酸、维生素、甾体激素等。工业化生产的微生物药物主要为抗生素(antibiotic)、氨基酸(amino acid)、维生素(vitamin)、核苷酸和核苷 (nucleotide, nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制剂(enzyme inhibitor)、免疫调节剂(immunomodulator)和受体拮抗剂(receptor antagonist)等。

1.3.3 酶工程技术制药

酶工程(enzyme engineering)是酶学和工程学相互结合渗透发展形成的，以应用为目的，研发新酶并生产、分离和纯化，包括酶的固定化及酶反应器及酶的分子设计等。酶工程制药的工艺结构紧凑、简单，高产、成本低，产品收率高、纯度好，可重复生产，对环境污染小。

酶工程技术在制药工业上的主要应用是（1）生物酶用于制备手性药物。目前已有50多种有机反应可通过微生物实现，广泛应用甾体激素、氨基酸、维生素和抗生素的制药中。（2）生物转化，给已有药物添加基团，增加药效和功能。黑根霉一步生物转化孕酮为11a-羟基孕酮，实现了甾体类激素的工业化生产。（3）固定化酶技术用于制药。用固定化大肠杆菌细胞（产生青霉素酰化酶）转化青霉素G、V，除去侧链生产无侧链青霉素，即6-氨基青霉烷酸。固定化5-磷酸二酯酶水解转化酵母RNA，生产5-复合单核苷酸。固定化氨基酰化酶拆分化学合成的DL-氨基酸，产生有活性的L-氨基酸。

1.3.4 细胞培养技术制药

动植物细胞培养(cell culture)是在离体条件下人工培养基上培养动植物细胞，使之生长繁殖并发育。细胞培养是建立在细胞学说基础之上，细胞具有全能性，即含物种所有遗传物质的细胞具有发育成为个体的潜在能力。

最早只有从正常组织中分离的原代细胞才能用于药物生产，如鸡胚细胞和兔肾细胞。以后，二倍体的传代细胞也可以用于生产，如WI-38和2BS细胞系。在消除了人们对非二倍体细胞的疑虑和担忧后，异倍体细胞广泛应用于制药。

动物细胞培养主要应用于生产人畜病毒疫苗、单克隆抗体、重组基因工程产品等。到目前，FDA批准了约60种动物细胞表达系统生产的生物技术药物，包括激素类、7种酶类、10种细胞因子、7种凝血因子、19种治疗性抗体、5种体内诊断用抗体。其他还有组织工程产品有4种，3种为组织工程皮肤，1种为组织工程软骨。大规模生产的疫苗有口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。目前约有70%批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且数目还在不断增加。动物细胞培养制药是药物生产的一个新领域。

1.3.5 基因工程技术制药

基因工程（gene engineering）制药是在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程，还可提高抗生素、维生素、氨基酸、核酸、辅酶、甾体激素等药物的生产能力。

1982年世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素获得FDA批准，由Eli Lilly公司正式生产，推向市场。重组微生物、转基因动植物为药物的生产提供了强大生物反应器。人类基因组计划的完成，以及随后蛋白质组、代谢组、糖组等后基因组时代的系统生物学技术的出现与发展，为制药设计提供了更多的功能性数据，对人类战胜疾病、提高生命质量具有重大意义。

基因工程技术首先在医药领域实现产业化，现在有60％～80％集中在医药领域，占主要地位的是基因工程药物的研究和商品化。到2004年2月，美国FDA批准的重组蛋白、核酸和疫苗类生物技术药物共79种。到2003年底，欧盟EMEA批准了49种基因重组蛋白质药物、11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。

世界生物技术药物的销售额将以年均10％～15％速度增加，基因工程药物在药物市场中将占15％。

1.4 化学合成制药技术发展

1.4.1 全合成制药

现代制药工业始于19世纪，染料化学工业的发展和化学治疗学说的创立，人们对大量的化工中间体和副产物进行了药理活性研究，药物合成突破了仿制和改造天然药物的范围，转向合成与天然产物完全无关的人工合成药物，如扑热息痛、磺胺类药物，开创了化学合成制药。

20世纪初期，化学药品大多是在德国。金黄色物质、吖啶类和偶氮染料(Azodyes)抗菌活性的研究，磺胺染料的合成，理化性质和构效关系的研究，总结出了磺胺类药物的结构与抑菌活性的关系，并由此开发出了数十个临床应用的磺胺药。磺胺类药物的问世在化学合成药及其临床治疗上具有里程碑的意义，极大地推进了现代医药工业的发展。20世纪30年代以后，全合成得到大发展，激素类药物、维生素C等相继合成，实现了工业化生产。

1.4.2 半合成制药

20世纪60年代新型半合成抗生素工业崛起，获得了青霉素的母核6-氨基青霉烷酸并研究了半合成青霉素和头孢菌素C，得到了耐酸、耐酶、对耐药菌株有效的广谱青霉素，进入了用化学方法对已有的抗生素进行化学结构改造的新时期，开辟了抗生素研制的新途径。

20世纪70年代，随着新的有机合成试剂、新的合成技术、新的化学反应的不断得到应用，促进了药物合成的发展，使合成药物的品种和产量迅速增长，生产规模日益扩大。出现的一系列钙拮抗剂、血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂和3-羟基-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂。

20世纪80年代，诺氟沙星（氟哌酸）正式用于临床后，引发了对喹诺酮类抗菌药的研究热潮，开发出了环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星等一系列抗菌药物。这些抗菌药和一些抗生素的成功应用，成为合成抗菌药发展史上的重要里程碑。

1.4.3 手性制药

20世纪90年代，在世界上兴起了手性药物。由于数理科学、化学科学、生物科学、计算机科学及技术的飞速发展和相互交叉及渗透，使人们能够采用更多、更先进的手段来设计和合成新的药物，合成的新药向疗效高、毒副作用小、剂量小的方向发展。因此，采用单一对映体（即手性药物）供药成为现代医药工业的一项紧迫任务。手性药物工业是国际制药工业新兴的一个领域，它将是本世纪制药工业的一个挑战。

1.5 制药工业的发展

制药工业（pharmaceutical industry）的历史大约70多年，但一开始就发展很快，目前全世界制药企业超过10000家，生产制造5000多种药物，其中约100家为跨国公司。现代制药工业的发展可追溯到19和20世纪之交，那时只有4种药物：洋地黄用于治疗各种心血管疾病，奎宁用于治疗疟疾，吐根属植物提取物（活性成分为生物碱）用于治疗痢疾，水银用于治疗梅毒，但当时缺乏安全性和有效性。随着生物学和有机化学的发展，能人工合成某些药物，如阿司匹林，从而诞生了化学制药公司，19世纪末成立了Bayer和Hoechst公司。尽管如此，直到20世纪30年代，制药工业才开始大发展，发现并能化学合成磺胺类药物，用于治疗细菌性感染。20世纪40年代大规模生产青霉素，建立了很多现代领头制药企业，如Eli Lilly、Wellcome、Glaxo、Roche等。20世纪70年代以后，出现现代生物技术制药公司。

世界制药行业具有以下特征。

（1）并购风云不断，重组形成更大集团，强强联合优势互补，战略性驱动，企业经营的专业化，企业间的合作。并购数量增加，药品生产的集中度不断提高。

（2）研发费用持续上升，投入继续增大，国际10大制药公司的年均投入占销售额的16％左右。1个新药的研发费用约8－10亿美元，但新药批准上市的数目在下降。研发的难度越来越大，新产品是行业的希望。

（3）重磅炸弹药物数目持续增加，从1995年到2004年，增长了近4倍。跨国公司更多依赖于重磅炸弹药物，是企业的主要利润来源。

（4）生物技术药物异军突起。20世纪80年代以前是治疗性药物，20世纪90年代是改善生命质量的药物，而进入21世纪，将是靶向的蛋白质、多肽和核酸类治疗性药物。

目前，全世界生物技术公司4400多家，主要集中在欧美，美国1444家，欧洲1815家，加拿大472家，亚太地区685家。年产值超过10亿美元的生物技术公司有20余家。

美国是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家，美国70％的生物技术产品集中在生物药品。美国生物技术制药形成规模化的公司有Amgen、Biogen、Chiron、Schering-Plough、Eli Lilly、Merker、Genentech、Hoffman-La Roche、Smith Kline Beecham、Genzyme、Ortho Biotech等20余家公司，其中Genentech、Amgen、Biogen、Chiron和Genzyme的销售额在名列前茅。

1.5.2 中国制药工业发展

中国制药工业的发展经历了从药店到厂房，再到现代化企业和集团的过程，由于制药行业的特点，决定了将永远是不断重组和兼并的发展过程。

1840年鸦片战争后，西药的引入中国，制药工业逐渐发展起来。

19世纪50年代开始建立的早期西药房，经营进口药，但未形成制药工厂或企业。清末洋务运动期间，也未见有制药厂的兴建。

20世纪20～30年代，上海、广州是我国近代制药工业的发祥地，虽得到一定的发展，受到连年的战争和帝国主义的控制，人才匮乏、化学工业与机械工业薄弱等因素，制药工业十分落后。只有少数中小型制药厂，生产品种少。而且以制剂生产为主，原料药的制造很少。生产厂规模不大，设备简陋，资金很少，产品单一。

1949年新中国成立初期，重视医药工业的发展，确定了“以发展原料药为主”的方针。同时，积极发展药物制剂生产。1951年试制出第一批结晶青霉素，1958年，以生产抗生素为主的华北制药厂建成投产，抗疟药物氯喹、伯喹和乙胺嘧啶相继合成并投产。1960年建成太原制药厂投产磺胺药。合霉素、氯霉素、磺胺药等原料药生产车间相继建成投产，摆脱进口局面。生化原料药胰岛素、胃蛋白酶、人造牛黄、胆固醇等相继生产。至1959年，中国建立起化学制药工业，改造、扩建和新建了一批车间和厂房。开启了中国制药的新篇章。

20世纪60－70年代，半合成抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素的研究发展十分迅速，半合成的青霉素类品种增加到十几种。合成了很多抗疟疾药物。甾体工业已发展到相当规模，改进工艺，增加品种，提高产量。在地方病用药、抗肿瘤药物、维生素类、心血管类、神经系统药的合成研究或结构改造上都得到了很大发展。

20世纪80年代后，走上了按正规制药工业管理和发展的道路。1984年原料药产量5.2万吨，1986年在原料药产量6.3万吨，1987 年原料药6.5万吨。1988年主要原料药产量7.18万吨，生产青霉素1700吨，1990年产量8.4万吨。

1.5.3 中国制药工业的现状

1.5.3.1 医药产业规模

医药行业包括化学制药工业、中成药工业、中药饮片工业、生物制药工业、医疗器械工业、制药机械工业、医用材料及医疗用品制造工业、其他工业。从1996年以来，医药工业的增长速度高于GDP的增长速度。1991－1995年发展速度最快，年平均增长率为22％，1996－2000年年平均增长率17％，2001－2003年年均增长17.5%。在2004年医药行业工业总产值中，化学制药在医药工业中保持主导地位。化学制药占53.81%，中药制药占26.86%，生物制药占6.4%，医疗器械占8.32%，其他占4.62%。

20世纪90年代以后，中国制药行业快速发展，根据国家GMP标准对厂房进行设计和建设产品生产的专业化和先进的药物生产线。由于GMP的强行行业认证，我国制药企业数量从2001年以来呈下降趋势，2004年，化学制药企业2000家左右，其中化学原料药864家，化学制剂1057家，中药企业1000多家。

化学原料药是中国医药行业的优势品种，中国现已成为世界原料药第二大生产国，青霉素及内酰胺类药物和维生素的最大生产国和出口国。2004年化学原料药工业总体规模世界领先，化学制药行业共实现工业总产值1929.2亿元，实现利润146.8亿元。2004年化学原料药实现工业总产值841.0亿元，同比增长12%，利润50.2亿元。2004年生物制药产业实现工业总产值271.55亿元，同比增长24%，完成销售收入248.95亿元，同比增长22.08%，创造利润25.19亿元，工业总产值及销售收入均高于医药制造业总体增长。预测在未来3至5年内，中国生物医药产业会保持25％左右速度快速增长。

1.5.3.2 医药产品结构

国际制药业销售以专利药为主体，中国正处于从仿制向创新为主体转换的关键阶段。从中国医药产业的产品结构看，以占制药工业55%的化学药为例，中国具有自主知识产权的创新药仅占约3%。生产化学原料药近1500种，总产量80万吨，位居世界第2；生产化学药品制剂34个剂型、4000余个品种；现代中药剂型40多种，总产量已达37万吨，品种8000余种。生产疫苗、类毒素、抗血清、血液制品、体内外诊断试剂等各类生物制品300余种，其中现代生物工程药品20余种；能生产预防制品约9亿人/份。生产包括X射线断层扫描成像装置、磁共振装置等在内的医疗器械11000多个品种、规格；可以生产8大类1200多个规格的制药机械产品。

2002年全国医药总产值占GDP的3.2%。中药总产值784亿元，化学药2102亿元，生物药物184亿元。化学药占行业的61％，年增长30％；中药占23％，年增长7％；生物药物占6％，年增长31％。抗生素生产企业140多家，原料药产量5万吨，制剂企业420家，产量588.9亿支/瓶/片。维生素原料药产量8.2万吨，企业50多家，制剂产量281亿支/瓶/片。氨基酸原料药7.4万吨，企业20多家，制剂产量1亿支/瓶/片。味精生产企业180多家，产量121万吨。柠檬酸生产企业100多家，产量42万吨。酶制剂生产企业200多家，产量35万吨。2002年高于医药产业平均水准的是制药机械(28％)、化学制剂(21％)；低于平均的是中药(16％)、生物制药(16％)、卫生材料(15％)、及医疗器械(12％)。

1989年rhuIFN-α1b申报新药，1993年获得批准试生产。rhuIFN-α1b采用中国人基因克隆和表达，是我国第一个拥有自主知识产权的上市基因工程药物。p53基因药物、结合型灭活甲乙肝疫苗、流感疫苗、重组人血管内皮抑制素注射液等被SFDA相继批准。目前SFDA批准上市30种生物药物，正在中检所完成或正在进行的生物技术药物约80余种，生物技术制药的规模正在形成。

1.6 制药技术展望

制药行业是一个集约化、国际化程度极高的产业。国外公司在中国设立研发机构，并把生产制造中心向中国转移。“十一五”时期乃至更长时间我国医药市场需求将继续保持旺盛势头。中国医药市场今后5年内将以15％～20％的速度发展，到2010年将达到240亿美元，成为继美国、日本、德国和法国之后的世界第5大医药市场，2020年将达到1200亿美元，超过美国成为全球第一大市场。从制药业各子行业看，未来5～10年期间，我国医药市场将继续保持以化学药为主，生物技术制药已经成为制药行业的新领域，天然提取制药有很大发展空间。

1.6.1 创新药物研究

加大制药的科研开发投入，研究并拥有自主知识产权的药物和技术。我国现有常用西药4 000多种，其中97％属于仿制国外产品或进口药。化学制药须从仿制变为创新，摆脱简单仿制国外产品的局面，建立新药创制和相关技术创新的机制。现代生物技术产业是全球重点发展的产业，现在是我国生物制药发展的关键时期。采用组合生物化学、生物分子芯片、细胞组织和动物模型等高通量的方法筛选天然药物，发现新型治疗药物。利用人类基因组和蛋白质组以及病原生物体的基因组的最新成果，计算机技术，把生物信息学、分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的技术综合起来，通过突变、生物展示、嵌合、质谱分析等，进行新型药物的辅助设计和药物筛选，特别是蛋白质药物和核酸药物，研究并建立新型药物筛选模型及其新技术、新方法，获得创新性药物。

通过基因工程技术，改变重组蛋白类药物的结构，如将单链变成双链和增加活性位点，从而增强活性，延长体内的半衰期，达到减小剂量和减少注射次数的目的。已上市的tPA改变成TNK-tPA，将EPO变成ARANESP，改构的重组TNF等。

重组蛋白类药物、寡核苷酸药物、合成肽、小分子抗体等的化学修饰，改变药代动力学和生物利用度，延长半衰期，提高疗效，使之成为新一代药物。

生物分子修饰的化学药物也获得了巨大成功，2005 年2 月获FDA 批准了American Bioscience (ABI) 公司的ABRAXANE (paclitaxel protein-bound particles for injectable suspension)，是利用人白蛋白制成的纳米颗粒结合紫杉醇注射制剂，代替了传统的紫杉醇制剂中容易引起患者过敏反应的有害溶剂，患者无需再注射肾上腺酮来防止溶剂过敏反应，大大加强了紫杉醇的临床效果和安全性。

1.6.2 抗体工程制药技术

FDA批准上市的生物药物中，抗体类药物所占比例越来越大，2004 年有11 个，3个为全新药物，其它为新适应症。抗体类药物一上市就成为年销售额逾亿美元的重磅炸弹药 (blockbuster drug)。基于单克隆抗体的治疗剂主要的应用领域是癌症，上市的抗体药物一半都在营利。目前上市的18 mAbs，在美国有8种已达3千万美元，其中4种是重磅炸弹药物，每年获利超过10亿美元。预计单抗药物的全球销售额将从2004年的50多亿美元增至2010年的150亿美元，平均年增长30%。

1.6.3 制药工艺新技术及其改造

应用现代科学技术改造我国传统的医药工业，使我国制药行业的经济实现由速度型向效益型、由粗放型向集约型的根本转变，用先进的制造技术进行药物生产。以生物技术等高技术为依托，开发医药产品与技术的新领域，加强生物技术制药的研究、开发和产业化，特别是下游的工艺过程，实现制药技术结构的战略转移。利用基因代谢工程技术和细胞工程原生质体融合技术，与传统生产技术相结合的方法，改造和构建抗生素、维生素、氨基酸等药物生产新菌种，提高发酵水平，降低消耗，提高生产效益。把固定化技术与生物转化相结合，研究大规模半合成抗生素的生产工艺技术，应用现代生产技术生产高效低毒的广谱抗生素。应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业和开发甾体激素，并对现在传统生产工艺进行改造。

哺乳动物细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面将持续并且其所占比例有逐年扩大趋势。研究适用于大规模药物生产的动植物和微生物表达系统，提高药物生产效率的新途径。动物细胞大规模培养技术仍未很好解决，产业化困难重重。需要加大力度研究，实施产业化工程，有望解决问题。

目前世界上正在开发的新药中，手性化合物约占70％，正在进行Ⅱ/Ⅲ期临床试验的药物中，80%为单一异构体。手性药物技术、反应合成与分离的耦合、化学与生物技术融合正成为新一代的制药技术。

加强环境保护与质量意识。原料药的生产的主流将继续，但要抓住高端原料药的竞争。研究和推行清洁工艺，推行清洁生产，控制污染总量。提高化学药物的合成药水平，特别是提高化工中间体的合成药技术。扑热息痛(对乙酰氨基酚)年产近3万吨、出口近2万吨，以对硝基氯苯或苯酚为起始原料，工艺落后，污染重，成本高。减少消耗高、污染重、附加值低的原料药出口，增加技术含量高、附加值高的原料药和制剂出口。

2.1 微生物发酵与制药

2.1.1 微生物发酵制药

2.1.1.1 抗生素的发现

1928年，英国细菌学家Fleming B发现抗菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种抗生素，50年代发现了20余种，60年代开始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际生产和应用的只有100余种。

2.1.1.2 发酵制药种类

发酵：通过微生物的培养而获得产物的过程。常常用产物说明，冠以某某发酵，如青霉素发酵，维生素发酵等。发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。

（1）微生物菌体发酵

微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。

（2）微生物酶发酵

微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6－氨基青霉烷酸。

（3）微生物代谢产物发酵

①初级代谢产物：氨基酸，核苷酸，维生素，有机酸。

②次级代谢产物：最主要的是抗生素。

（4）微生物转化发酵

利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。

2.1.1.3 制药微生物的种类

生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）产生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacterium flarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。

放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多，诺卡菌属较少，还有小单孢菌属。生产的抗生素主要有氨基糖苷类（链霉素、新霉素、卡那霉素等）、四环类（四环素、金霉素、土霉素等）、放线菌素类（放线菌素D）大环内酯类（红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大环内酯类（制霉菌素、抗滴虫霉素等）。酸性、碱性和中性，但以碱性为多。

真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类，多为酸性化合物。

2.1.2 发酵制药的基本过程

发酵制药就是利用制药微生物，通过发酵培养，在一定条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得药品。菌株选育（mutation and selection breeding）、发酵(fermentation)和提炼(isolation and purification)是发酵制药的三个主要工段。主要过程如下。

工艺过程包括发酵和分离纯化两个阶段。

生产菌种选育与保存：菌种选育使青霉素的产量由最初20单位提高到80000单位以上。优良菌种应该高产、性能稳定、容易培养。

发酵阶段包括生产菌、孢子制备、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程。

孢子制备：保存的菌株，在固体培养基上，复苏，生长产生孢子。

种子制备：将制备的孢子接到摇瓶或小发酵罐内，培养，使孢子发芽繁殖。对于大型发酵，普遍采用2次扩大培养制备种子，最后接入发酵罐。

发酵：将种子以一定的比例接入发酵罐，培养，是生产药物的关键阶段和工序。需要通气，搅拌，维持适宜的温度和罐压。发酵一定周期。期间，取样分析，无菌检查，产量测定。加入消泡剂、酸碱控制pH，补充碳源、氮源和前体，促进产量。

分离纯化阶段包括发酵液处理与过滤、分离提取、精制、成品检验、包装、出厂检验，是化学分离工程过程。

发酵液的预处理与过滤：使发酵液中蛋白质和杂质沉淀，增加过滤流速，使菌丝体从发酵液中分离出来。如制霉菌素、灰黄霉素、曲古霉素、球红霉素药物存在于菌丝中，要从菌体中提取。如果存在于滤液中，澄清滤液，进一步提取。

提取与精制：吸附、沉淀、溶媒萃取、离子交换等从滤液中把药物提取出来。精制是浓缩或粗制品进一步提纯并制成产品。可重复或交叉使用四种基本方法。

成品检验：包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热源试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。

成品包装：合格成品进行包装，为原料药。制剂由制剂车间或厂再分装。

2.2 制药微生物生长与生产关系

2.2.1 制药微生物的生长特性

2.2.1.1 微生物的生长与繁殖

生长和繁殖是两个完全不同的概念。生长是细胞原生质总量或体积的增加，繁殖是细胞分裂而出现细胞数目的增加。细菌的繁殖方式是无性二等分，而放线菌则主要是通过产生无性孢子，菌丝断片也可以繁殖。霉菌以无性孢子和有性孢子及菌丝繁殖，酵母进行出芽生殖和裂殖。

2.2.1.2 微生物细胞的分化

分化是菌丝体产生不同形态类型细胞的过程，包括菌体营养细胞的分化和孢子的形成。细胞的分化受遗传性和环境因素的相互作用所控制。

2.2.2 制药微生物发酵的基本过程特征

根据菌体生长与产物生成的特征，可把发酵过程分为菌体生长期（cell growth phase）、产物合成期(product formatting phase)和菌体自溶期(cell autolysis phase)三个阶段。

2.2.2.1 菌体生长期

菌体生长期（cell growth phase）也称为发酵前期(fermentation prophase)，是指从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。菌体的主要代谢是进行碳源、氮源等分解代谢，培养基质不断被消耗，浓度减少，而菌体不断地生长和繁殖，浓度增加。溶氧量不断下降，达到菌体临界值时，溶解氧浓度降到最低。培养基的pH也随着变化，有的菌种，开始适当上升，然后下降；这是首先利用氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用，pH有下降。有的菌种，开始适当下降，然后上升。这是首先利用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，而后又被利用所致。培养液的物质消耗或菌体浓度或溶解氧浓度达到一定水平时，其中一个参数就成为菌体生长的限制因素，菌体生长减慢。同时大量生成并积累中间代谢产物，酶受到调控，改变了代谢途径，菌体的生理状况发生改变，初级代谢转向次级代谢，由菌体生长阶段过渡到产物合成阶段。

2.2.2.2 产物合成期

产物合成期 (product synthesis phase)也称为产物分泌期(product secretion phase)或发酵中期(fermentation metaphase)，主要进行次级代谢产物或目标产物的生物合成。产物量逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。呼吸强度无明显变化，菌体在增重，但不增加数目。以菌体DNA含量作为菌体生长繁殖的标准来划分生长阶段和产物合成阶段，其界限是很明显的，即菌体生长恒定（即DNA含量达到定值）就进入产物合成阶段。以菌体干重作标准则有交叉，因为菌体数量虽无增加但多元醇、酯类等细胞内含物仍在积累，菌体干重增加。碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。培养基质的分解代谢与产物合成代谢并重，不断分解消耗碳源、氮源等，不断合成产物。对外界变化敏感，容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。碳、氮、磷酸盐等物质必须控制在一定有效浓度范围内，否则，培养基质过剩造成菌体生长繁殖，抑制产物合成；而培养基质不足，菌体生长量少，容易衰老，合成能力也下降。发酵条件如pH、温度、溶解氧等参数也要严格控制。

2.2.2.3 菌体自溶期

菌体自溶期(cell autolysis phase)也称为发酵后期(fermentation anaphase)，菌体衰老，细胞开始自溶，氨基氮含量增加，pH上升，合成产物能力衰退，生产速率减慢。发酵必须结束，否则产物被破坏，同时菌体自溶给过滤和提取等带来困难。

2.2.3 制药微生物的生长动力学

在适宜的培养基中接入菌种，每隔一定时间取样测定细胞数目和生物量、发酵参数（培养基成分和培养条件）、产物生成等，对发酵时间作图，就得到了动力学曲线。细胞群体量随发酵时间的变化曲线为微生物生长动力学曲线。微生物生长动力学曲线描述了微生物由接种到自溶死亡整个过程。发酵过程中培养液会变粘稠，液体的流变学特性影响氧传递、热传递和混合等过程。分批式培养过程分为以下几个时期。

2.2.3.1 延迟期

延滞期（lag phase）或适应期是指接种后，菌体的生物量没有明显增加的一段时间。延迟期是菌体适应环境的过程。延迟期时间长短不一，与遗传和环境因素有关，由菌体与环境相互作用的程度决定的。因不同接种量、不同菌种和菌龄等而表现不同。工业上希望延迟期越短越好，常采用如种子罐与发酵罐培养基尽量接近，对数期的菌体作为种子、加大接种量等方法进行放大培养和发酵生产。

2.2.3.2 对数生长期

对数生长期（log phase）是菌体快速繁殖，生物量的增加呈现对数速度增长的过程。特点是生长速率达到最大值，并保持不变。细胞的化学组成与生理学性质稳定。菌体生长不受限制，细胞分裂繁殖和代谢极其旺盛。可以认为细胞组分恒定，菌体细胞的生长速率与生物量是一级动力学关系

对数期比生长速率达到最大值，

对数期μmax是个常数，因此细胞生物量倍增时间（doubling time）可以表示为：

不同生物由于μmax值不同，倍增时间差异很大。微生物细胞μmax较大，倍增时间约为0.5～5小时。

对于单细胞一分裂为二的基因工程菌，如细菌和酵母，细胞数目倍增时间就是世代时间，td可表示为：

其中，t为n次分裂的总时间，Nt为n次分裂后细胞数目，N0为分裂前的细胞数目。根据对数期中一定时间内的细胞数目的变化，可求出倍增时间。

2.2.3.3 减速期

减速期(decline phase)是指菌体生长速率下降的一段时间。由培养基中基质浓度下降，有害物质积累等不利因素引起。在减速期内，生长速率与菌体浓度仍符合一级动力学关系，但受基质浓度限制。一般生物的减速期较短。

2.2.3.4 静止期

静止期或稳定期（stationary phase）是指菌体净生长速率为零的一段时间。由于营养耗竭、代谢产物或有毒害物质的积累，菌体浓度不增加，细胞的分裂与死亡同步进行，生长速率与死亡速率相等，达到平衡。符合如下方程：

其中kd为死亡速率常数。

最大菌体浓度：

特点：①细胞数达到最大值，②生长速率与死亡速率处于一种动态平衡，③细胞内开始积累贮存物，④大多数芽孢菌形成芽孢，⑤次级代谢产物在此阶段合成。

静止期往往是目标产物生成的主要阶段，为了延长稳定期以增加次级代谢产物的合成，产生上常常在此期进行补料培养，增加营养物质，提高产物量，如青霉素发酵时流加葡萄糖。

2.2.3.5 衰亡期

衰亡期（death phase）是指菌体死亡速率大于生长速率的一段时间。表现为细胞自溶、死亡加速，细胞浓度迅速下降。菌体死亡速率也符合一级动力学：

特点：①死亡速率迅速增加，②细胞数量显著下降，③细胞产生多种形态，如原生质体凝聚，形成菌丝片段。对于分批发酵培养，大多数在衰亡期到来前结束发酵，进行放罐。

2.2.4 基质利用的动力学

在菌体的生长过程，随着基质逐渐被吸收利用，基质浓度呈现降低。

基质浓度的减少可用基质消耗速率（rs）和比消耗速率（qs）表示

；

比消耗速率表示基质被利用的效率，可用于不同微生物之间的发酵效率的比较。

限制性基质浓度与比生长速率的关系与酶促反应的Michaelis-Menten方程非常相似，可用Monod方程表示：

其中μmax为限制性基质过量时的最大比生长速率，Ks 为饱和常数，相当于1/2最大比生长速率时的基质浓度。

从方程可见，在S很低时，可以近似认为Ks + S＝Ks，则μ =μmax S/Ks，表明基质浓度与比生长速率成正比。在S很高时，可以近似认为Ks + S＝S，则μ =μmax，表明在高基质浓度下，菌体能以最大比生长速率进行生长。

μmax意义在于各种基质对菌体的生长效率，可用于不同基质之间的比较。Ks意义在于菌体对基质的亲和力，Ks越小，亲和力越大，即越能被菌体良好利用。

2.2.5 生长与产物的关系模型

从菌体生长、能源利用和产物生成速度的变化及其之间的动力学关系出发，Gaden把发酵过程分为三种模型。

I型：菌体生长与产物生成偶联型(coupling model)。菌体的生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致的。产物往往是初级代谢的直接产物，菌体生长、糖的分解代谢、能源利用和产物形成几乎平行，生长期与生产期是一致的，菌体生长期和产物形成不是分开的。细胞生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，都有最大值，出现的时间接近。组成型表达的基因工程菌的产物生成属于此类型，蛋白质产物是细胞能量代谢的结果。乳酸、醋酸等初级分解代谢产物的生成也属于此类型。所以产物生成速率和比速率分别为：

II型：菌体生长与产物生成半偶联型（semi-coupling model）。该模型介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。产物来自能量代谢所用的基质，但是在次级代谢与初级代谢分开的。在细胞生长期内，基本无产物生成，在生长的中后期生成大量的产物而进入产物形成期。分批发酵出现两个高峰，先是基质消耗和菌体生长的高峰，然后是产物形成的高峰。如柠檬酸和某些氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物也属于此类型。产物生成速率和比速率分别为：

；

其中α、β为常数。

III型：菌体生长与产物生成非偶联型（non-coupling model）。菌体生长期与产物生成期为独立的两个阶段，先形成物质消耗和菌体生长高峰，几乎没有或很少有产物生成，然后进入菌体生长静止期，产物大量生成，并出现产物高峰。产物可能来自于中间代谢途径，而不是分解代谢过程，物质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢途径，初级代谢与产物形成是完全分开的，如抗生素、生物碱、微生物毒素的发酵。对于诱导型基因工程菌，往往在静止期，加入诱导物，基因转录和产物表达，所以产物生成速率和比速率分别为：

；

2.2.6 代谢产物的生物合成

代谢（metabolism）是生物体内进行的生理生化反应的统称。代谢分为分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)，前者是指把大分子降解为小分子的过程，为合成代谢提供能量和原料；而后者是指把小分子合成为复杂大分子的过程，满足细胞生长和分化的需要。

初级代谢是营养物质转变为细胞结构物质和对细胞具有生理活性作用的物质，为细胞提供能量、合成中间体及其生物大分子的代谢网络。在初级代谢过程中形成的产物为初级代谢产物（primary metabolite），包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。几乎所有生物的初级代谢基本相同。

次级代谢存在于某些生物中，并在一定时期表达。次级代谢对正常的生长可能不必要，但对抵抗逆境、分解毒素、生殖等具有重要意义。

2.2.6.1 次级代谢产物生物合成的基本特征

（1）次级代谢产物种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物和化学键。如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、生物碱、内酯、核苷、杂环等基团，聚乙烯不饱和键、大环、环肽等键。

（2）具有种属特异性，与种属分类学无关。分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌既可以产生氨基环醇类抗生素，又可以产生大环内酯类抗生素。分类学上不同的菌种能产生相同结构的抗生素，如霉菌和链霉菌均可产生头孢菌素C。一种微生物的不同菌株产生结构不同的多种次级代谢物，而同一菌株会产生一组结构类似的化合物。

（3）生长期转向生产期，形态与生理发生变化。次级代谢产物是在细胞生长后期开始形成，当生长受限制时被启动。完成菌体营养生长期（trophophase）之后，出现次级代谢物合成期（idiophase），其生物合成比生长对环境更敏感，要求更高。次级代谢产物是以初级代谢产物为前体，受到初级代谢的调节。可能是缺乏某种营养成分，菌体生长抑制，启动了次级代谢物合成。菌体内中间代谢物积累，抑制了初级代谢酶，使之消失或活性下降，诱导了新酶的出现，转入生产期。芽孢杆菌形成芽孢，放线菌和真菌形成孢子，抗生素合成可能是细胞分化的伴随现象。

（4）次级代谢产物是结构相似的一组混合物，但活性差异较大。参与反应的酶的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上的初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，并继续对该产物进行修饰生成多种衍生物。一种次级代谢产物可由两种或两种以上代谢途径合成。

（5）次级代谢产物的合成受多基因控制。往往以基因簇形式存在。除染色体外，还有细胞质遗传物质，可能存在于质粒、线粒体基因。遗传物质的变异和丢失是导致菌种退化和生产不稳定的重要因素，所以具有代谢不稳定性。

2.2.6.2 次级代谢产物的构建单位

微生物合成的次级代谢产物是由微生物代谢产生的一些中间产物，如由碳水化合物降解生成的五碳（C5）、四碳（C4）、三碳（C3）、二碳（C2）化合物和初级代谢产物合成。

把构成次级代谢产物的基本结构单位称为生源（biogen）。生源直接或间接来源于次级代谢过程的中间产物或初级代谢产物。构建单位包括聚酮体、甲羟戊酸、糖类、不常见的氨基酸（如D－氨基酸、β－氨基酸等）、环多醇和氨基环多醇等。

（1）聚酮体（polyketide）

是含有多羰基的聚合物。许多抗生素如四环素类、大环内酯类、蒽环类抗生素的前体是聚酮体，构成聚酮体的前体与脂肪酸合成的前体相似，基本单位为乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸，起始单位为乙酰CoA、丙酰CoA、丙二酰CoA、丁酰CoA等，分别供给2、3、4 C单位。经过缩合、脱羧、还原、脱水，每次延长2－3个碳单位，形成多酮次甲基链。再还原后形成多种聚酮体。重复脱水得到四环素和蒽环抗生素的母核，环化后形成大环内酯结构。如果内酯环的不饱和链较多，则形成多烯大环内酯。

（2）糖类

主要有氨基糖、糖胺、核糖、环多醇和氨基环多醇等，形成抗生素有氨基糖苷类抗生素，如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素等。葡萄糖活化成酮糖，在转氨酶作用下形成氨基糖。含有氨基糖的抗生素有新霉素B、多烯大环内酯类，含有糖胺的有大环内酯、氨基糖苷类的链霉素等。它们的共同前体是葡萄糖。氨基糖是以葡萄糖为前体，合成己酮糖，再经过转氨作用，将氨基转移到糖分子上。环多醇和氨基环多醇是葡萄糖酸化、环化及氨基化反应的结果，形成氨基环醇类抗生素。

（3）不常见的氨基酸

不常见的氨基酸是指非蛋白质组成氨基酸，包括D-氨基酸、N-、β-甲基氨基酸、β-氨基酸、亚氨基酸等，如D-谷氨酸、D-苯氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-鸟氨酸、异丝氨酸、异酪氨酸、肌氨酸、α-氨基己二酸等。这些氨基酸是正常氨基酸通过异构、消旋、修饰而形成的。一些是初级代谢产物。不常见氨基酸是肽类抗生素的构建单位，如杆菌肽、放线菌素D、环孢菌素A等。青霉素、头孢菌素等生物合成也是利用非蛋白质氨基酸。

（4）莽草酸

莽草酸是芳香族氨基酸、肉桂酸、多酚化合物的前体。由葡萄糖初级代谢生成阿拉伯庚酮糖酸磷酸，脱磷酸、环化形成苯环，再脱水、加氢形成莽草酸。

（5）甲羟戊酸

甲羟戊酸是异戊二烯类、萜类化合物的构建单位，通过乙酸代谢生成。2分子乙酰CoA缩合，生成乙酰乙酰CoA，再与乙酰CoA缩合，生成3-羟基3-甲基戊二酰CoA，再还原生成甲羟戊酸。磷酸化形成活性形式异戊二烯焦磷酸，用于合成生物碱、甾醇和胡萝卜素等药物的生物合成。

非核酸嘌呤和嘧啶碱是核苷类抗生素的构建单位，是正常碱基的化学修饰形成。

2.2.6.3 次级代谢产物的生物合成的基本过程

次级代谢产物的合成基本过程包括构建单位的聚合—再修饰—装配。在此过程中，次级代谢产物的累积受合成途径中某些酶活性的限制，这些关键酶活性大小与产量正相关。

（1）前体聚合

微生物合成生源后，通过缩合反应形成聚酮体、寡肽、聚乙烯等。

各种聚酮体的合成过程相似，只是起始单位和延长单位不同。聚酮体是2－6个二碳单位的聚合反应的结果，酮基被保留，或只是还原为羟基。聚酮体可直接形成环，如四环素类和大环内酯类。进而被修饰，与相应基团如氨基糖、糖胺等结合，形成结构和生理活性不同的化合物。乙酰CoA羧化形成丙二酰CoA，再与8个丙二酰单位缩合形成9酮化合物，再转化为中间体三环化合物。甲基化、还原、脱水、加氢、氧化形成4氧脱水四环素，加氯形成4氧脱水氯四环素，转氨形成4氨基脱水氯四环素，再甲基化形成脱水氯四环素，脱氢氯四环素，最后形成氯四环素。大环内酯是2－4碳单位缩合而成。

氨基酸的聚合有三种形式：氨基酸活化成磷酸酯，再被酶催化缩合，如谷胱甘肽；蛋白质的核糖体模板合成途径；多酶复合物将氨基酸活化后，按硫模板或非核糖体机理缩合，形成肽链。氨基酸与ATP反应，在羧基上形成腺苷单磷酸酯被激活。氨基酸被转移到酶的巯基上，形成硫酯键。硫酯键断裂，提高能量，使2个氨基酸之间形成肽键（羧基与氨基结合）。依次，形成多肽链。如短杆菌肽S是由2条5肽首尾连接而成。

（2）结构修饰

包括糖基化、酰基化、甲基化、羟基化、氨基化、氧化还原等，使抗生素产生了共存的系列类似物。在聚酮体链延长的过程中，伴随许多基团的化学修饰，如引入氧、氯原子、甲基等，再以糖苷键与糖类物质连接，酰胺键与氨基酸连接，形成各种抗生素。如四环素类，先形成聚酮体，在C7位发生氯化则是金霉素，在C5位上先氧化后还原则是土霉素。

（3）装配

合成各个组分后，需要按一定顺序在特异酶作用下组装，才能形成有活性的药物。

2.3 制药微生物菌种的建立

发酵生产药物，需产量高的菌种，自然界中的菌种趋向于快速生长和繁殖，而发酵工业需要大量积累产物，因此菌种选育很重要。常规方法是利用天然变异，从中选择优良株系。随后物理因子（紫外线、X射线、中子、激光等）和化学因子（烷化剂、碱基类似物等）和生物因子（噬菌体、抗生素）诱变育种。20世纪80年代，以原生质体融合的杂交育种和基因工程育种，90年代以后，可以用基因组shuffling育种。

2.3.1 新药生产菌的选育

2.3.1.1 自然分离

（1）样品的采集与处理

从大陆土壤、海洋水体等环境中采集样品，表层土壤（0－10cm），海洋（0－100m）。根据分离目的和微生物的特性预处理。较高温度（40－120℃）处理几十分钟至几小时，甚至几天，可分离到不同种类的放线菌。化学试剂如SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。

（2）分离方法

选择适宜的培养基，满足微生物营养需要和pH条件，添加抑制剂，有利于富集。加入抗真菌试剂和抗细菌抗生素，可以富集放线菌。

分离方法有稀释法和滤膜法。用无菌水、生理盐水、缓冲液等稀释后，涂布平板。用0.22－0.45 μm培养，细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。放线菌可在25－30℃、32－37℃或45－50℃下培养，7－14天至1月。

（3）活性测定

非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。用HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。

2.3.1.2 自然选育

在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫自然选育或自然分离。自然选育的常用方法是单菌落分离，需要反复筛选，确定生产能力比原菌株高的菌种。基本过程如下：

菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力测定→选出优良菌株。

自然选育简单易行，可达到纯化菌种、防止退化、稳定生产水平和提高产量的目的。但效率低，增产幅度不会很大。

2.3.1.3 诱变育种

诱变育种是人为创造条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，当前菌种选育的一种主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单。但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。

（1）诱变剂

诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。物理因素包括各种射线，紫外线、快中子、X射线、R射线、激光、太空射线等。化学因素包括碱基类似物，2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等；与碱基发生反应的物质，硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥、羟胺等；DNA嵌合剂，丫啶类，溴化乙锭等。生物因素包括噬菌体、质粒等。这些因素最终使遗传物质DNA的一级结构发生变化，从而导致性状变异。

（2）诱变育种方案的设计

诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。首先制定诱变方案，进行诱变实验。选择好出发菌株（starting strain），产量较高，对诱变剂敏感。进行诱变处理，交叉使用多种诱变剂比一种效果更好，对诱变剂进行合理组合。根据致死率和诱异率，确定适宜的诱变剂量。最好是既能增加变异范围，又有大量的正向变异。其次，确定筛选目标和方案，进行筛选。除高产外，还有生长速度快，产孢子多，有效利用廉价碳源等。筛选应该施加一定的选择压力（selective pressure），如抗生素、基质浓度等，或生理作用，有针对性进行。

2.3.1.4 杂交育种

杂交育种是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株。带有定向育种的性质。

方法1：接合（conjuction）

直接混合培养两个菌种，通过接合而形成异核体（heterocaryon, 菌丝中含有遗传特性不同的细胞核），进而产生分生孢子。个别细胞核发生融合，得到杂合二倍体，极少数发生染色体交换，得到重组型二倍体，进而筛选得到高产菌株。

方法2：原生质体融合(protoplast fusion)

用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，在高渗条件下，用聚乙二醇（PEG）促进原生质体发生融合，再生细胞壁，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。

原生质体融合育种首先要建立细胞再生体系，这样保证了融合后的原生质的有效再生。一般要求两个亲本菌种具有明显的遗传标记，便于融合后的有效筛选。除了PEG化学促进融合外，还有电融合等其他物理方法，融合效果都很好，但需要相应的仪器。链霉菌的原生质体融合的基因组重组率高达20％。最近，基于原生质体融合的基因组shuffling是细菌单染色体细胞的有效育种方法，属于分子定向化育种范畴。

2.3.1.5 基因工程技术育种

采用基因工程技术即基因克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组基因，调控代谢过程，实现目标产物的高效表达。一般希望外源基因整合到染色体中，以便稳定遗传。在传统抗生素、氨基酸、维生素发酵的育种中具有重要意义。

2.3.1.6 基因组shuffling技术

DNA shuffling（重排，改组，重洗） 又称有性PCR(sexual PCR)，是一个反复突变和重组的循环过程，从一组相关基因的随机片段（来自不同种类生物，具有相关功能的基因），通过无引物PCR的方式重新组合，装配新功能重组（recombination）基因，生产有用或有潜力的新基因产品。这些基因，再次被酶切成片断，再一次重组成新的组合基因，此过程一再重复，一直到具有高品质的蛋白质产生。

基因组shuffling与DNA shuffling类似，操作对象为单染色体组成的基因组。原生质体融合时，基因组发生重组形成突变候选库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌株，即经济适用的菌株。以前的随机突变和选择（至少10－20轮）为工业微生物筛选了优良菌株，但对表型改进仍然困难，因为表型是由分布在基因组中的一批基因决定。基本过程如下：

（1）随机突变获得单个性状优良的菌株

（2）多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）

（3）再次重复循环融合，得到融合库F2、F3、F4

（4）筛选鉴定

基因组shuffling的关键是起始突变体的选择、遗传重组的效率、选择方法的灵敏性。已经在泰乐霉素生产菌的改造、蛋氨酸生物合成途径的进化等方面取得明显效果。

2.3.2 菌种保存

目的：保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。

保存原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。

2.3.2.1 斜面低温保存

也称定期移植保存，可用于生产菌种的短期保存。利用低温降低菌体的新陈代谢，使菌种的特性在短时间内保持不变。菌种接在适宜的平板培养基上或斜面试管中，在生长温度下，生长至旺盛期，然后置于低温冰箱内，一般4℃，湿度小于70％，进行保存，每隔一定时间移植转移一次。该方法的优点是操作方便，使用便利，缺点是保存时间短，容易发生变异。

2.3.2.2 液体石蜡密封存保藏

生长好的斜面菌种或穿刺培养物，加入灭菌的液体中性石蜡油，覆盖厚度1cm左右，封闭管口，然后置于4℃低温下保存，约1年。石蜡封存，可减少水分蒸发并隔绝了氧气，增加了保存时间。但该方法不适于能利用石蜡油的菌种。

2.3.2.3 砂土管保藏

黄砂：泥土＝3：2或1：1，灭菌并无菌检查后与孢子混合，使孢子吸附在砂土上。置于干燥管中，真空泵抽气干燥后，使砂土外形松散。置于干燥器中，冰箱低温下保存，可达一年以上。对分生孢子霉菌、放线菌和芽孢细菌，可保存5－10年。只适宜于有孢子或芽孢的菌种，不适用于只有菌丝的真菌和无芽孢的细菌和酵母保存。砂土起保存载体的作用。硅胶、滤纸、瓷珠等可用于保存。

2.3.2.4 冷冻干燥保藏

生长好的菌体与细胞保护剂（脱脂奶或血清等，见表）混合，制成菌悬液在－35℃～－45℃（酒精或干冰）下预冻15分钟至2小时，使细胞快速冻结而不受破坏，保持细胞的完整性。然后低温真空干燥。封瓶后，低温避光保存。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害，有利于菌体的复苏。冷冻干燥保存时间长，一般5～10年，多达15年。

2.3.2.5 液氮低温保藏

菌体培养物，加入细胞冷冻保护剂5～10％甘油和二甲基亚砜（DMSO）制成孢子或菌悬液，浓度一般大于108个/ml。分装于小的安瓿瓶或聚丙烯小管后，密封。先降至0℃，再以每分钟降1℃的速度，一直降至－35℃，然后放液氮罐中保存。也可直接置于液氮中速冻，然后在液氮中保存或在－80℃冰箱中保存，是目前最可靠的一种长期保存方法。保护剂的作用在于降低细胞的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

2.3.3 菌种保存机构

2.3.3.1 中国典型培养物保藏中心

中国典型培养物保藏中心：China Center for Type Culture Collection (CCTCC)，(武汉大学保藏中心)。

2.3.3.2 中国科学院典型培养物保藏委员会

中国普通微生物菌种保藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)

中国工业微生物菌种保藏管理中心：China Center of Industrial Culture Collection（CICC）

抗生素菌种保藏管理中心（CACC）：

中国医学微生物菌种保藏中心：National Center for Medical Culture Collection (Bacteria)，CMCC

2.3.3.3 国外主要保藏机构

WFCC：World federation for culture collections, http://www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml

ATCC: American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/

IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan

NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK

2.4 培养基制备

培养基（medium）是供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。

2.4.1 培养基的成分

2.4.1.1 碳源

凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。包括糖类、醇类、脂肪、有机酸等。糖类有单糖（葡萄糖，果糖）、双糖（蔗糖、乳糖）、多糖（淀粉、糊精），常用葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜。糖蜜是制糖的副产物，主要成分为蔗糖，是价廉物美的碳源。脂肪有豆油、棉籽油和猪油，醇类有甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇，长链碳氢化合物以石油产品的正烷烃，14-18碳的混合物。以脂肪作为碳源时，必须提供足够的氧气，否则会引起有机酸积累。

2.4.1.2 氮源

凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源。可分为有机氮源和无机氮源两类。常用有机氮源有黄豆饼粉（最常用）、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素等。有机氮源含有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸，水解后提供了主要的氨基酸来源。同时，含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素、某些生长因子等，微生物生长更好。此外，含有代谢的前体，有利于产物的生成。

常用无机氮源有铵盐、氨水和硝酸盐。铵盐中的氮可被菌体直接利用。硝酸盐中的氮必须还原为氨才可利用。无机氮源可以作为主要氮源或辅助氮源，氨盐比硝酸盐更快被利用。

根据氨盐利用后，残留物质的性质，把无机氮源可分为生理酸性物质和生理碱性物质。生理酸性物质是代谢后能产生酸性物质，如(NH4)2SO4利用后，产生硫酸。生理碱性物质是代谢后能产生碱性物质，如硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。生产中常常加入无机氮源来调节pH值，一举两得。

2.4.1.3 无机盐和微量元素

无机盐（mineral salt）和微量元素(trace element, microelement)是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸）、硫、铁（细胞色素）、镁、钙（调节细胞膜透性）、锰、铜、锌（辅酶或激活剂）、钴、钾、钠（调节渗透压）、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。各种盐成分的使用浓度见表。

生物对磷酸盐的需要量较大，但在不同阶段是不同的。微生物生长的磷酸盐对次级代谢产物合成有重要影响。对抗生素发酵，采用生产亚适量（对菌体生长不是最适合但又不影响其生长的量）的磷酸盐浓度。

对于特殊的菌株和产物，不同的元素具有独特作用，铜能促进谷氨酸发酵，锰能促进芽孢杆菌合成杆菌肽，氯离子促进金霉素链霉菌合成四环素。钴是维生素B12的组成元素。加入微量钴，促进VB12产量，也能增加链霉素、庆大霉素的产量。

2.4.1.4 水

菌体细胞的主要成分，营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。

2.4.1.5 生长因子

生长因子（growth factor）是指微生物生长不可缺少的微量有机物，包括氨基酸、维生素、核苷酸、脂肪酸等。一般天然成分中含有，无需添加。但对于营养缺陷型（氨基酸、核苷酸）菌株，必需添加。

2.4.1.6 前体与促进剂

前体是加入到发酵培养基中的某些化合物，能被直接参与产物的生物合成，组成产物分子的一部分，而自身的结构没有发生多大的变化。前体明显提高产品产量和质量，一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的方向。前体不仅有毒性，而且被菌体分解，因此多次少量流加工艺。

在抗生素等次级代谢产物的发酵中，经常添加前体(precursor)和促进剂(accelerant)，以提高产量。前体可以是产物的中间体，也可以是其中的一部分。

2.4.1.7 消沫剂

消除泡沫，防止逃液和染菌。一般为动植物油脂和高分子化合物。

2.4.2 培养基的种类

培养基的种类繁多，按组成、状态、用途分类。

按组成分类：合成培养基(synthesized medium)，成分明确。天然培养基(natural medium)，成分不完全明确，有一些天然物质。半合成培养基(semi-synthesized medium)，用途分为选择性培养基(selective medium)、鉴别性培养基(identification medium)、富营养培养基(nutrient medium)等，

按物理性质分类：固体培养基(solid medium)，半固体培养基(semisolid medium)，液体培养基(liquid medium)。

按发酵过程中所处位置和作用分为以下几类。

2.4.2.1 斜面或平板固体培养基

斜面固体培养基（solid medium）包括细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。在液体培养基添加1.0％～2.0%的琼脂粉（agar）制成固体培养基。作用是提供菌体的生长繁殖，形成孢子。特点是菌体生长迅速，产生优质大量的孢子，但不能引起变异，营养丰富。单细胞培养基要含有生长繁殖的各类营养物质，包括添加微量元素、生长因子等。丝状菌的孢子培养基，基质浓度较低，无机盐浓度适量，以利于孢子形成。营养不宜太丰富，否则不易产生孢子。

2.4.2.2 种子培养基

种子培养基（seed medium）是供孢子发芽和菌体生长繁殖，包括摇瓶和一二级种子罐培养基，为液体培养基。作用是使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。培养基成分必需完全，营养丰富，含有容易利用的碳、氮源和无机盐等，但总体浓度不宜高。孢子发芽快，细胞生长迅速，能繁殖大量的菌体，菌体健壮，提高各种代谢酶活力。由于生长时间较短，生长快速，为了缩短发酵的停滞期，种子培养基要与发酵培养基相适应，成分应与发酵培养基的主要成分接近，不能差异太大。

2.4.2.3 发酵培养基

发酵培养基(fermentation medium)是提供微生物进行目标产物的发酵生产，不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。要求是接种后菌体能迅速生长到一定密度或浓度，又能合成目标产物。营养物质浓度要高些，在组成上，不仅要有满足菌体生长所需的物质，还要有特定的元素、前体、诱导物和促进剂等对产物合成有利的物质。不同菌种和不同产物，对培养基的要求差异很大。供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用，组成应丰富完整，营养成分浓度和粘度适中。

2.4.2.4 补料培养基

补料培养基(fed medium)是发酵过程中添加的培养基。为了工艺条件稳定，有利于微生物的生长和代谢，延长发酵周期，提高目标产物产量，经常采用前期培养基稀薄一些，从一定时间开始，间歇或连续补加各种必要的营养物质，如碳源、氮源、前体等。补料培养基一般按单一成分配制，在发酵过程中各自独立控制加入，或按一定比例制成复合补料培养基，再加入。

还有一些特殊用途的培养基，如分离纯化培养基、原生质体再生培养基、鉴别培养基、生物检测培养基（测定抗生素生物效价）。

2.4.3 影响培养基质量的因素

对于发酵过程首先要选择合适的培养基。培养基的组成和配比是否恰当对菌体的生长、产物的生成、提取工艺的选择、产品的质量和产量等都有很大的影响。培养基都是由水、碳源、氮源、无机盐等组成，具有一定pH和渗透压。对某一菌种和产品而言，究竟用哪些原料作培养基还需经过一系列实验的摸索才能确定一种既有利于基因工程菌生长又能保证得到高产优质产品的较为理想的培养基配方。另外，工业生产培养基所用的原材料还必须来源丰富、价格低廉、质量稳定。当然，一种好的培养基配方还应随菌种的改良、发酵控制条件和发酵设备的变化而作相应的变化。

2.4.3.1 原料质量

培养基所用原料主要为复合大分子化合物，如玉米奖、黄豆饼粉、花生饼粉、淀粉等农副产品和蛋白胨、酵母粉等，常常因加工原材料的品种、产地、加工方法、贮存条件不同而质量差异较大。化学原料如各种无机盐类化合物，杂质含量也不相同，其纯度对培养基的质量也会造成影响。

培养基原料的选择应注意碳源和氮源种类和数量的影响。虽然大多数碳源对菌种生长的能力相似，不同碳源对菌种生长的能力和产物的生产能力很不相同，对产物的生成影响很大。碳源过多，有机酸形成多，容易引起pH降低；碳源过少，引起菌体衰老和自溶。选择氮源也很重要，不同微生物对最适氮源的要求不同。同时要注意碳氮配比，氮源过多，会使营养生长过旺，pH偏高，不利于产物的积累；反之，氮源不足，菌体量生长少，也会影响产物生产。速效和缓效成分相互配合，发挥综合优势。不同生长阶段，对碳氮源的要求也不不同，要根据微生物菌种来确定。微生物对pH的要求在于，处于一定酸碱环境下，才能生长发育和生存。配制培养基时可加入酸碱性物质搭配，在生长过程中，根据工艺和设备，控制在最适范围之内。

对原料要试验选择，一旦选定后，不宜随意更换，保持稳定原料来源。在更换原料时，必需进行一系列试验，确保产量和质量的控制和稳定性。

2.4.3.2 水质

深井水、自来水、地表水、蒸馏水。水是培养基的主要成分，恒定水源和恒定的水质很重要。水质的主要参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物特别是重金属的种类和含量。优良基因工程菌有时不能高产，可能是劣质水造成的，生产中要注意。对水质定期化验检查，使用符合要求的水质配制各种培养基。菌种和种子培养基可以用蒸馏水，而生产用水必需使用超纯水，可避免相应的污染。

2.4.3.3 灭菌的影响

高压蒸汽灭菌是生产中常用方法，但控制不当，很容易直接影响培养基的有效成分甚至是活性。较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产生有毒物质。磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或络合物，降低了对磷酸和铵离子的利用。维生素、激素等在高温下被分解破坏、失活。应该将糖与其他组分分开灭菌。有研究显示糖类单独湿热灭菌，基本消除焦化现象。在能达到完全灭菌的情况下，采用高温快速灭菌是有效的措施。

灭菌会引起培养基的pH变化。一般情况下，灭菌会使LB培养基的pH增加0.1～0.2,糖类灭菌造成的酸化也很严重。

2.4.3.4 培养基的黏度

培养基中的固体不溶性成分，如淀粉、黄豆粉等增加了培养基的黏度，不仅影响发酵的通气搅拌等物理过程，而且直接影响菌体对营养的利用，也给目标产物的分离提取造成困难。高黏度的培养基，也不易彻底灭菌。生产中可用精料发酵、基础原料用酶水解，降低大分子物质，或补加灭菌水，来降低黏度。

2.4.4 发酵培养基的配制

2.4.4.1 一般原则

（1）生物学原则：根据不同微生物的营养和反应需求，设计培养基。营养物质组成较丰富，浓度适当，满足菌体生长和合成产物的需求。各种成分之间比例恰当，特别是有机氮和无机氮源，C/N比。一定条件下，各种原材料之间不能产生化学反应。具有适宜的pH和渗透压。

（2）工艺原则：不影响通气和搅拌，又不影响产物的分离精制和废物处理，过程容易控制。

（3）低成本原则：原材料要因地制宜，来源方便，丰富，质量稳定，质优价廉，成本低。

（4）高效经济原则：生产安全，环境保护，高质量，最高得率，最小副产物。

2.4.4.2 培养基的设计基本思路

（1）根据他人的经验和成分，初步确定培养基的成分，作为研究的起始培养基。

（2）单因素实验，确定最适宜的培养基成分。

（3）多因素实验，进行各成分之间浓度优化和最佳配比。如均匀设计、正交实验和响应面分析等统计学方法。

（4）从摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。

（5）综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。

2.4.4.3 理论计算与定量配制

微生物生长和生产可用下列表达式表示：

碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产物＋CO2＋H2O＋热量

如果能进行定量表达，就可计算得到一定细胞生物量所需最小的营养物质。如果已知生物量与产物之间的特殊表达关系，就可以计算获得一定产量的最小底物浓度。可参考微生物的化学元素组成（表），做初步计算培养基配方。由于培养基成分的复杂性和所起作用的差异，一般针对碳源和氮源进行转化率计算和分析。

转化率是单位质量的原料生产的产物量或细胞量。理论转化率是理想状态下，根据代谢途径的物料衡算结果，而实际转化率是发酵过程中实际测量得到的数值。所以理论转化率高于实际转化率，而使实际转化率靠近理论转化率是发酵控制的最终目标。理论衡算是建立代谢过程非常清楚的基础之上，但很困难，所以对代谢过程简化后，可以定量计算。

工业生产用培养基的确定需要大量细致和周密的试验研究。目前还无法从生化反应的基本原理来推断和计算出最佳培养基配方，只能根据生理学和生物化学的基本理论，参照前人所用的经验培养基，结合生物学和产品特征要求，对培养基的成分进行深入试验。

2.5 灭菌工艺

杂菌（contaminated microbe）：对于发酵生产过程，除生产菌以外的任何生物微生物。

污染（contamination）：感染杂菌的发酵体系。

污染的后果：杂菌不仅消耗营养物质，干扰发酵过程，改变培养条件，引起溶解氧和培养基黏度降低等变化；还会分泌一些有毒物质，抑制生产菌生长；杂菌分泌酶，分解目标产物或使之失活，产量大幅度下降；噬菌体（phage）的污染引起溶菌；杂菌污染直接影响后续工序的有效进行，甚至是产品的质量。

消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物（pathogen），达到无害化程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。

杀菌：杀灭或清除病所有微生物的过程，杀灭率99.9999%以上。

灭菌（sterilization）：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。

灭菌是十分重要的工序，包括培养基、发酵设备及局部空间的彻底灭菌、通入空气的净化除菌。常用的灭菌方法主要有化学灭菌、物理灭菌两类。

2.5.1 常用灭菌方法与原理

2.5.1.1 化学灭菌

化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。常用化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾、过氧化氢等，卤化物类如漂白粉、氯气等，有机化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、环氧乙烷、2％新洁尔灭、3%～5％石炭酸等。使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。化学灭菌主要适合用于皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。

2.5.1.2 辐射灭菌

物理灭菌包括使用各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌，效果好，操作方便，广泛使用。各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力，其中以紫外线最常用。原理在于核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。但紫外线穿透力极低，只适宜于表面灭菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。

2.5.1.3 干热灭菌

在高温120℃以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物释放，生物体死亡。对于干热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160℃、2h，或170℃、1h干热空气，用于需保持干燥的器械、容器的灭菌。温度越高，时间相应缩短。

2.5.1.4 蒸汽灭菌

湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下，穿透力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。一般在115℃～140℃，保持一段时间，可以杀死各种生物体。由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭菌。常用条件为115℃～121℃，压力1×105Pa，维持15～30分钟。芽孢是一种休眠体，外面有厚膜包裹，耐热性很强，不易杀灭。因此在设计灭菌操作时，经常以杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增加50％的保险系数。

灭菌过程中，高温会使营养成分受到一定程度破坏。灭菌活化能大大高于营养物质分解活化能，因此应尽量减少灭菌时间和温度。从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物的死亡速率加快，而且比营养物质分解速率快得多，因此高温短时灭菌可达到相同灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。这就是高温短时灭菌的理论基础。实践证明，在能达到完全灭菌的情况下，采用高温短时灭菌是有效的措施。

培养基的pH、原料成分及泡沫对蒸汽灭菌效果有一定影响。不同原料所含杂菌数量不同，pH在6～8内，蛋白质、糖、油脂等物质的存在，对微生物起包裹作用，使微生物对热的抗性增加，不易死亡。pH在6.0以下，微生物对热较敏感，容易杀死，低pH下灭菌时间可缩短。颗粒的存在容易形成灭菌的死角，泡沫的操作阻碍了蒸汽的流动，并形成隔热层，灭菌效果大大降低。这些因素在灭菌操作中应该予以重视。

2.5.1.5 培养基的过滤除菌

有些培养基成分受热容易分解破坏，不能使用蒸汽灭菌，常常采用过滤器除菌。常见的有蔡氏细菌过滤器、烧结玻璃细菌过滤器和纤维素微孔过滤器等。蔡氏细菌过滤器采用石棉滤板，烧结玻璃细菌过滤器的除菌用规格为小孔径的烧结玻璃。纤维素微孔滤膜有醋酸纤维素和混合纤维素等几种质地，具有一定的热稳定性和化学稳定性，孔径规格为0.1～5μm不等，一般选用0.22μm，进行溶液过滤除菌。

2.5.2 培养基的灭菌

2.5.2.1 分批灭菌操作

将配制好的培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。特点是不需其他的附属设备，操作简便，国内外常用。缺点是加热和冷却时间较长，营养成分有一定损失，罐利用低。为中小型生产企业采用。

使物料溶胀并均匀受热，至90℃以上，通入蒸汽，达到121℃开始计算维持时间，生产中习惯采用30分钟。快速冷却，以减少营养物质的破坏，灭菌结束时，立即通入无菌空气，以维持罐压，然后开启冷却系统进行冷却。

灭菌时间计算

分批灭菌时间包括加热升温、保温和降温冷却三个阶段，灭菌主要在保温阶段实现，但升温和降温阶段也有一定贡献。习惯上，保温阶段的时间为灭菌时间，主要计算灭菌时间和热量。升温是采用夹套、蛇管中通入蒸汽直接加热，或在培养基中直接通入蒸汽加热，或两种方法并用，得以实现。在升温阶段，一般认为100℃以上才能起到灭菌作用，它对灭菌的贡献占20％。保温阶段的贡献占75％，降温阶段的贡献只有5％。总体完成灭菌的周期约3－5小时。

根据微生物浓度和比死亡速率，通常以耐热芽孢杆菌为对象，可以计算灭菌时间。

对于热量计算，涉及所需蒸汽量。可用温度、传热系数、培养基质量、比热、换热面积进行衡算。空罐灭菌的消耗蒸汽体积为罐体积的4－6倍。

操作过程

排放夹套或蛇行管中凉水，开启排气阀。由空气管通入蒸汽，对培养基加热。夹套通入蒸汽进行间接加热。

在70℃左右时，从取样管、放料管通入蒸汽。

在120℃时，罐压1×105Pa，打开接种、补料、消泡、酸碱等管阀，排气，并调节进汽和排气量，进行保温维持。料液下的管道都应通入蒸汽，料液上的管道都应排放汽。

保温结束后，依次关闭排气、进汽阀，罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温，使培养基降到所需温度。

2.5.2.2 连续灭菌操作

培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，即连消。

特点：1）可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；2）发酵罐利用率低；3）热能利用合理，易于自动化控制；4）不适合粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；5）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。6）对压力要求高，不小于0.45 MPa，一般为0.45-0.8 MPa。

加热器两种，塔式加热器和喷射式加热器。

塔式加热器：一根多孔蒸汽导管和套管组成。培养基从下端进入，流速0.1m/s，蒸汽从塔顶进入，从小孔中喷出，与培养基激烈混合。塔高2－3m，培养基的停留时间20－30s。

喷射式加热器：培养基从中间管进入，蒸汽从料管周围的环隙进入，在喷嘴处快速混合。国内大多数企业采用。

保温设备包括维持罐和管式维持器两种。用保温材料包裹，不直接通入蒸汽。

料液从维持罐上端连续通入到罐底，维持一定时间后，靠罐压流入冷却器。返混严重。

管式维持器：蛇管状，培养基在管内处于湍流区，活塞流动状态，返混为零。

降温：喷淋式冷却器为主，螺旋板式换热器，板式换热器，真空冷却器等。

操作过程：

配料：配料罐，配制培养基。

预热罐：定容和预加热。70－90℃。

加热器（连消塔）：培养基与蒸汽混合，快速升温达到灭菌温度，126－132℃。

维持罐：维持保温培养基的灭菌时间。5－7分钟。

冷却管：从维持罐出来的料液经过冷却水管冷却。40－50℃。输入灭菌底发酵罐中。

2.5.3 空气过滤除菌

空气的组成：氧气、二氧化碳、氮气的混合物，其中还有水汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。

空气严格除菌，达到无菌状态，才能使用。工业中制备大量空气的方法有加热灭菌、静电除菌。在发酵工业中，大多采用过滤介质（filter medium）除菌方法制备无菌空气。

2.5.3.1 原理

微生物体积很小，空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5μm。过滤介质可以除去游离的微生物和附着在其他物质上的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降，同时惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒，颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一定作用。

膜过滤技术已得到发展，膜过滤器也用来空气除菌，常用的滤膜有硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜等。其原理在于微生物和微粒（约0.5-20μm） 等大于滤膜的网眼直径(0.3μm)，被直接截留于表面。另外沉降作用和静电吸附对除去微粒和尘埃等也有一定贡献。

2.5.3.2 发酵空气的标准

连续一定流量的压缩无菌空气。空气流量：VVM：单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3），一般在0.1-2.0。压强：压力表显示0.2-0.4 MPa，克服下游阻力。空气质量：相对湿度小于70％；温度比培养温度高10－30℃；洁净度100级，或失败率10－3。

2.5.3.3 空气预处理与设备

采风塔：在工厂的上风头，高度一般在10m左右，设计流速8m/s。可建在空压机房的屋顶上。

粗过滤器：安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气中较大的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定除菌作用。介质为泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式），流速0.1-0.5 m/s。要求是阻力小，容灰量大。

空气压缩机：作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。

空气贮罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供均匀连续空气可省去。设置在空压站附近。

冷却器：空气压缩机出口气温一般在120℃，必需冷却。在潮湿季节，除湿。空气冷却器的传热系数为105W/(m2 ℃)。采用双程或四程结构，两级串联使用。第一级循环水冷却，第二级低温水（9℃）冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每经过1m管道，温度下降0.5-1.0℃。

2.5.3.4 油水分离与设备

气液分离设备：除去空气中油和水，保护过滤介质。旋风分离器和丝网除沫器两类。

旋风分离器，利用离心沉降原理。结构简单，阻力小，分离效率高。压缩空气的速度15－25m/s，切线方向进入旋风分离器，在环隙内做圆周运动，水滴或固体颗粒被甩向器壁，而收集。完全除去20μm以上离子，对10μm离子的分离效率为60－70％。

丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98％。

空气加热设备：空气相对湿度仍然为100％，需要降到70％以下，才能进入空气过滤器。列管式换热器，空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器，空气走管程，蒸汽走夹套。

2.5.3.5 空气过滤介质与设备

要求除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染，阻力小，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤维纸、石棉滤板等。

绝对过滤器：介质孔径小于被截留的微生物体积，如四氟乙烯、纤维素树脂微孔滤膜。

深层过滤器：介质空隙对于被截留的微生物体积，但有一定厚度，靠静电、扩散、惯性、拦截。棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉过滤、金属烧结管等。

实验室采用一级过滤器，生产规模设置二、三级过滤器，第一级为总过滤器，二、三级为分过滤器。

纤维及颗粒介质过滤器：圆筒形，直径2.5－3m。孔径10－15mm。空气从下方进入，上方引出。常用介质棉花、玻璃纤维、活性炭等。空气流速0.2-0.3m/s。可作为总过滤器。

过滤器的灭菌：通入蒸汽，0.2－0.4MPa，45分钟。压缩空气吹干，备用。总过滤器每月灭菌一次。应该有备用过滤器，灭菌时交换使用。

纸过滤器：超细玻璃纤维纸为介质，孔径1－1.5um，厚度0.25-0.4 mm，填充率14.8%。除菌效率很高，0.3μm粒子，99.99%。空气流速0.2-1.5 m/s。阻力很小。可作为终端过滤器。

金属烧结管过滤器：几十至上百根金属微孔过滤管安装在不锈钢壳体内组成。孔径10－30μm，处理能力达100m3/min。特点：寿命长，耐高温，阻力小，安装维修方便。可作为终端过滤器。

微孔膜过滤器：不锈钢中心柱，滤膜做成折叠型的过滤层，绕在中心柱上，外加耐热的聚丙烯套。特点：体积小，处理量大，压降小，除菌效率高，能除去0.01μm以上粒子。流速0.5-0.7m/s，压降小于100Pa。一般前置空气预过滤器、蒸汽过滤器，延长其使用寿命。膜材料有硼硅酸纤维，预过滤器，除去灰、垢；聚偏二氟乙烯，终端过滤器；聚四氟乙烯，终端过滤。

新型子弹状膜过滤器：过滤膜是“皱褶膜”，体积小，阻力小，过滤面积大，膜易更换。棉花和活性炭填充时，体积大，吸油水能力强。超细玻璃纤维纸除菌效率高，但易被水油污染。新型过滤器将取代传统过滤器。

2.5.3.6 空气过滤除菌的工艺流程

为了获得无菌空气，一般采用三个主要工段。

（1）提高空气的洁净度：前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损，减少介质负荷。

（2）除去空气中油和水：采用分级冷却，一级冷却采用30度左右的水使空气冷却到40－50℃，二级冷却器采用9℃冷水或15－18℃地下水，使空气冷却到20－25℃。冷却后，空气湿度提高了100％，湿度处于露点以下，油和水凝结成油滴和水滴，在空气贮藏罐内沉降大液滴。旋风分离器分离5μm以上的液滴。丝网除沫器分离5μm以下液滴。

（3）获得无菌空气：分离油水后的空气湿度仍然达100％，温度稍下降，就会产生水滴，使介质吸潮。加热提高空气温度，降低湿度（60％以下）。这样空气温度达30－35℃，经过总过滤器和分过滤器除菌后，得到符合要求的无菌空气。

2.5.4 无菌检查与杂菌控制

杂菌的检测与控制是十分重要的，杂菌的污染将严重影响产量和质量，甚至倒罐。

杂菌检测的主要方法为显微镜检测和平板划线检测两种，显微镜检测方便快速及时，平板检测需要过夜培养，时间较长。检测的原则是每个工序或一定时间进行取样检测，确保下道工序无污染。

发酵污染杂菌的原因复杂，但归结起来主要有种子污染、设备及其附件渗漏、培养基灭菌不彻底、空气带菌、技术管理不善等几方面。

2.5.4.1 无菌试验方法与染菌的判断

肉汤培养法：用装有酚红肉汤的无菌试管取样，放入37℃恒温培养。

斜面培养法：空白无菌试管取样，接种于斜面培养基，37℃培养。

种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次。

以酚红肉汤反应和双碟检查为主，镜检为辅。连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化，或双碟上连续3个时间样品长出杂菌，即判断为染菌。酚红肉汤不明显，要结合镜检。

2.5.4.2 培养基灭菌不彻底及其控制

培养基灭菌不彻底是常见的导致发酵过程被污染杂菌的原因。最主要原因是由于蒸汽压力或用量不足、灭菌时间不够引起的，灭菌时产生大量泡沫、有难溶固体颗粒或罐内污垢堆积也会直接影响了灭菌效果，另外设备制作或安装不当，蒸汽不能到达，造成灭菌死角。

根据造成灭菌不彻底的原因，可采取相应的措施。保证灭菌所需的蒸汽压力、用量和时间。为了防止产生大量泡沫，升温时间不宜太快，要适当；含糖和含氮培养基可分开灭菌，进气和排气阀门开启要缓慢。

2.5.4.3 空气带菌及其控制

空气过滤器效能下降，除菌失败，导致通入污染空气。空气除菌环节较多，每一个环节的失控就会导致灭菌失败。包括管件穿孔与渗漏带入杂菌和过滤介质松动、老化、吸潮等，使过滤除菌性能下降所致。

可通过定期检查管件、更换过滤介质和加强检修来解决。

2.5.4.4 设备及其附件渗漏引起的污染及其控制

发酵设备及其附件的渗漏是化学和电化学腐蚀、机械磨损共同作用引起的，一旦设备及其附件的渗漏，就会引起污染。冷凝蛇管和夹套的穿孔渗漏，会使冷却水污染杂菌。阀门渗漏，外界的空气或水会进入发酵罐，引起污染。

对于设备失修、渗漏引起杂菌污染，要建立并执行完善的管理制度、操作制度与规程，加强技术设备管理，定期检修和维护发酵设备及各个环节，杂菌污染是可以杜绝的。一旦发现污染，要及时处理。

4.1 制药动物细胞

4.1.1 动物细胞的结构与功能

4.1.1.1 动物细胞的结构与基础代谢

动物细胞属于真核细胞(eukaryotic cell )，其结构和成分更复杂，功能全面。在光学显微镜下，哺乳动物细胞由细胞膜(cell membrane)、细胞质(cytosol)和细胞核(nucleus)三部分组成，没有细胞壁(cell wall)。线粒体（mitochodrium）、内质网(endoplasmic reticulum)、核糖体（ribosome）、高尔基体(Golgi body)、质体(plastid)、微粒体(microsome)、溶酶体(lysosome)、中心体（centrosome）等亚细胞器，都由一层或二层生物膜包裹并区域化，成为独立的结构，行使各自的独特功能。

细胞的各种代谢活动都在亚细胞分区内进行，各区域被细胞膜所分隔。细胞膜包裹细胞，使之与环境分开，维持细胞渗透压和离子的交换。质膜是双分子磷脂组成，与原核细胞相同。膜上有受体，动物细胞膜对大分子具有胞吞和胞吐作用。

悬浮培养的动物细胞，呈球形，直径约7～20 μm，属于单细胞培养。但与微生物的显著不同，动物细胞没有坚硬的细胞壁，培养中对渗透压、剪切力、气泡撞击引起的损伤更敏感。

动物细胞的不同的代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域(表)。区域之间通过胞内运输（囊泡包裹）实现物质、信息和能量的流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间交换。

4.1.1.2 动物细胞培养的代谢特征

在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰氨是提供能量和合成代谢的前体。葡萄糖的限制可以通过增加谷氨酰氨的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰氨是动物细胞的氮源，在谷氨酰氨受限制时，可以通过增加其他氨基酸的消耗得以补偿。

动物细胞吸收葡萄糖后，主要途径有糖酵解（glycolytic pathway），把葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为丙酮酸进入三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA循环)，彻底氧化产生CO2和水。还有一小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP），把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞有毒性。

动物细胞吸收谷氨酰氨后，进入氨基酸代谢，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。

大多数谷氨酰通过脱氨生成谷氨酸，并释放氨离子。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。

谷氨酰氨的转氨作用，还可通过谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，α-酮戊二酸进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰氨在细胞能量代谢中具有重要作用。

谷氨酰氨与谷丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。

在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。谷氨酰胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生的氨，对细胞有毒性。

不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢是在丙酮酸上有重叠，在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰氨。

在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二者对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。

常用流加葡萄糖或谷氨酰氨，来控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。

4.1.1.3 蛋白质糖基化与分泌表达

细胞核内基因转录形成RNA，经过剪切和加工，形成mRNA，运送到与细胞核膜紧密相连的内质网膜体系上。粗糙内质网上有大量的核糖体存在，翻译合成蛋白质。粗糙内质网腔内有与膜和分泌性蛋白质翻译后的加工（糖基化）、蛋白质的水解酶等，具有加工剪切、磷酸化等功能，内质网合成各种糖类。蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白(glycoprotein)的寡糖结构容易发生变化。寡糖基是以共价键与蛋白质的氮或氧原子结合的，分别称为N-糖基化和O-糖基化（glycosylation）。

糖基化过程与产物的分泌紧密相连，发生在内质网和高尔基体上，有大量的糖基转移酶和糖苷酶控制。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。

尽管哺乳动物细胞具有胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。因此要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。

4.1.2 制药动物细胞的种类

4.1.2.1 有限细胞系

根据体外培养细胞的整个生命过程，可把细胞分为原代细胞（primary cell）和传代细胞(passage cell)。

从体内取出的组织细胞进行体外接种培养称为原（初）代培养(Primary culture)，原代培养的细胞为原代细胞，它生长分裂并不旺盛，与体内细胞相似，适合于药物检测实验。生产中有些产品仍沿用原代细胞，如鸡胚细胞、兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。

原代细胞转接后培养的细胞为传代细胞。传代后，细胞分裂增殖旺盛，能保持一致的二倍体核型，所以又称为二倍体细胞系(diploid cell)。

根据细胞的传代次数和寿命，可分为有限细胞系（finite cell line）和无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line）。正常细胞经过多次传代后，一般可连续培养30～50代，就会逐渐失去增殖能力，也就是说它们只能生长有限的时间，经过若干传代培养后将老化死亡，把这类细胞称为有限细胞系。大多数传代细胞都是有限细胞系，如人细胞最高培养次数为50～60代。二倍体传代细胞的增殖能力有限，所以也称为有限细胞系。如WI-38、MRC-5、2BS等用于生产。

4.1.2.2 无限细胞系

当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后，才能变为无限细胞系或连续细胞系。如肿瘤细胞就是自发形成的永久细胞系（immortal cell line），没有分裂次数的限制。物理（紫外线、X射线等）、化学（致癌因子诱变剂等）或生物因素（病毒感染、癌基因和突变基因转染等）也能获得此类细胞系，此时细胞的寿命是无限的，生长不受细胞密度的影响，也不具有接触抑制现象和细胞形状不规则、出现异常染色体的特性，非常适合于制药工业生产。

正常细胞染色体断裂形成异倍体，失去了正常细胞的特点，具有无限增殖能力，这就是异倍体连续细胞系。它对培养条件和生长因子等要求低，倍增时间短，是理想的药物生产细胞系。

如果采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰，获得具有独特性状的遗传学稳定的细胞，就是工程细胞系（engineered cell line）。如把正常传代细胞异倍体化，或融合或重组都可形成工程细胞系。

4.1.3 常见生产用动物细胞系

药物生产应用的主要细胞系是C127、CHO、BHK，以CHO为主，占44％。抗体生产全部用杂交瘤和CHO细胞系。

4.1.3.1 人源细胞株系

Namalwa：从淋巴瘤病人（Homo sapiens，human)中分离获得的类淋巴母细胞，含有部分Epstein-Barr病毒基因，但不表达完整的EB病毒。非整体核型，2n=12～14，单X染色体，无Y染色体。表达IgM悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大规模生产干扰素，并批准上市。

WI-38:美国Wistar研究所（Wistar Institute，WI）从正常人（Homo sapiens，human）胚肺组织分离获得的二倍体（diploid）成纤维（fibroblast）细胞系，贴附型生长，2n=46。细胞倍增时间24小时，寿命50代，第一个被用于制备疫苗。MRC-5也是正常二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，寿命为42～46代，也用于制备疫苗。

4.1.3.2 哺乳动物细胞株系

CHO细胞：从中国仓鼠（Cricetulus griseus）卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）中分离的上皮样（epithelial）细胞系，贴附型生长体性，是目前使用最为普遍和成熟的宿主细胞。对水泡性口炎和Getah病毒敏感。核型为亚二倍体，2n=22。分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。属于贴壁生长细胞，可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。有多个衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。采用二氢叶酸还原酶（DHFR）的缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ等已投放市场。在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，使外源基因高效表达。

BHK：从幼仓鼠的肾脏（baby hamster kidney, BHK）中分离的成纤维样细胞，非整倍体，2n=44。用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ，Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分别于1989和1994被FDA获准上市，1999年FDA批准Novo Nordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治疗血友病。

C127：从小鼠（Mus musculus，mouse）乳腺（mammary gland）肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴附型生长。被牛乳头病毒（bovine polyoma virus）DNA载体转染后，细胞形态发生明显变化。C127：LT细胞系，生长密度高，表达组成型大T抗原，可以识别和筛选。C127I细胞适合于牛乳头病毒DNA载体的转化。C127细胞系已表达多种外源基因，Serono公司生产rhGH（Saizen, Zorbtive）于1996年被FDA已被批准进入市场。

杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。不同的启动子在骨髓瘤细胞中都能发挥很好的作用。SP2/O－Ag14不分泌免疫球蛋白抗体链，可用8-氮鸟嘌呤筛选，用于抗体的制备。

Vero：从成年非洲绿猴（Cercopithecus aethiops，African green monkey)肾中分离获得的贴壁依赖性成纤维细胞，多倍体核型，66%细胞的2n=60，为连续细胞系。Vero E6最为常用，可增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产疫苗，被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。

4.1.3.3 昆虫细胞株系

Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。

Sf-9：是从秋黏虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，最常用的昆虫表达细胞。倍增时间为18～24小时，能高效表达外源基因。

TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。

4.1.3.5 鸡胚细胞

生产疫苗。

4.2 哺乳动物细胞生产特征

4.2.1 对培养条件要求严

动物无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。物理化学因素如温度、渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求苛刻，周围环境十分敏感。

4.2.1.1 温度

不同种类的动物细胞对温度的要求是不同的，变温动物对温度要求没有恒温动物严格。哺乳动物细胞最佳培养温度为37℃，鸡细胞为39℃～40℃，而昆虫类细胞为25℃～28℃。在培养过程中，根据细胞种类选择确定适宜的培养温度。

哺乳动物细胞的耐受温度范围较窄，在35℃～37℃内能正常进行代谢和生长，超出范围会引起细胞伤害甚至死亡。在39℃～40℃培养基1小时，细胞受伤，但能恢复。在41℃～42℃，受伤严重，部分可恢复。43℃以上，大多数死亡。细胞对低温的耐受性比高温要强，低温抑制生长，但无伤害作用。

4.2.1.2 氧气

动物细胞生长必须有氧气，大多数细胞缺氧时不能生存。离体培养的气体含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为21％。有时充以N2气稀释O2浓度。O2浓度在60%以上为高氧环境，对细胞毒性较大，往往抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。

4.2.1.3 pH值

绝大多数低于6.8或超过7.6会对细胞产生严重影响动物细胞，甚至使细胞死亡。机体细胞的pH范围为6～8，而且在血液和体液中，变化范围很小。人体血液pH比较恒定，维持在7.36～7.44。pH低于7.05会发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒。血液中有四个缓冲体系，碳酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系、血红蛋白缓冲液体系、血浆蛋白缓冲体系。其中碳酸盐缓冲体系数量最多、作用最大。H2CO3解离，提供H＋，与OH－结合，中和碱。NaHCO3提供HCO3－，接受H＋，中和酸。

4.2.1.4 渗透压

正常血浆渗透压（Osmotic pressure）范围为280～310 mOsm/kg（690～859kPa），主要是无机盐Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等构成血浆晶体渗透压起作用，而蛋白质构成胶体渗透压较小，不超过1.5 mOsm/kg。高于310 mOsm/kg的溶液为高渗溶液，低于280mOsm/kg为低渗透压溶液。动物细胞对渗透压有较强的耐受性，常用增减NaCl的浓度调整渗透压，每增加1mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。

4.2.2 对培养基的要求高

需要容易利用、丰富的相对低分子量的营养物，包括12中必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机盐和微量元素，多种附加成分。能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨。氮源：氨基酸单体化合物。

4.2.3 目标产物的特征

在动物细胞内，表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物，可克服原核表达对产物质量的不利影响。完善的翻译后蛋白质修饰功能，产品与天然的产物一致，装配折叠形成精确的三维结构，适于临床使用。动物细胞表达产物分泌到培养液，使分离纯化相对简单。

动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低，产量落后于其他表达系统。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。使用血清，费用较高，而且有潜在的血源性污染危险（逆转录病毒）致病因子、免疫原性存在。不同细胞系的表达水平差异较大，因此，表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系统的研发重要内容。

4.3 动物细胞培养基的制备

4.3.1 培养基的成分

由于动物细胞对培养基的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境。主要组成成分包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。

4.3.1.1 糖类

糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量ATP，主要是葡萄糖。不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。

4.3.1.2 氨基酸

谷氨酰胺是体外动物细胞培养的重要碳源和能源。21种氨基酸中至少12种是必需氨基酸，包括精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）等。这些氨基酸必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长。

4.3.1.3 维生素

维生素是一类微量的小分子有机生物活性物质，既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，对代谢和生长起调节和控制作用。水溶性维生素包括B族维生素和维生素C，脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K四种。

4.3.1.4 无机盐类

胞内的无机盐是细胞代谢所需酶的辅基，同时保持细胞的渗透压和缓冲pH的变化。胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。Na＋是重要的胞外阳离子，Na＋和Cl－参与生理电活动，具有维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡的作用。离体培养为细胞提供足够的Na和Cl离子是基本条件，一般为生理盐水的离子浓度（0.9% NaCl）。

Ca2＋、Mg2＋是细胞的构成成分，对细胞间的互黏稳定起重要作用。碳酸盐缓冲液是重要的体内缓冲体系，与K＋、Cl－等在维持酸碱平衡具有重要作用。微量元素有Fe、Zn、Cu、Mn、Co、Mo、F、Se、Cr、I等是酶的组成成分，调节酶活性。

4.3.1.5 生长类因子及激素

胰岛素是最常用的激素，使用浓度为1～10μg/ml，对细胞的生长有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲状腺素、乳激素、生育酚等。细胞因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子，根据不同细胞添加。为了细胞的贴壁生长，必需添加贴附因子，如纤维结合蛋白、胶原等。

脂类化合物对动物细胞培养是必需的，实际中类脂及其前体和血清常平行使用。添加的蛋白质试剂主要有铁传递蛋白，起离子载体的作用。有时用无机铁盐，如硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁等代替铁传递蛋白。

4.3.2 培养基的种类

4.3.2.1 天然培养基

天然培养基是最早期人们采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，而且不稳定，来源也受到限制，不宜大量培养和生产使用。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富含氨基酸。

血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，有些成分功能明确，另外一些成分功能不明确。血清的来源有胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和新生牛血清。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。

4.3.2.2 合成培养基

合成培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，可大量供应。合成培养基发展至今已有几十种，大部分已商品化。由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成培养基也不同，在动物细胞培养中最常用培养基7－8种，如BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。

由于天然培养基的一些成分仍然不清楚，不能用已知的化学成分代替，因此必需在合成培养基中添加5％~10％的小牛血清。在杂交瘤培养中，要求更严格，添加浓度更高，一般为10％～20％的胎牛血清。血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会组成一定的不便。

4.3.2.3 无血清培养基

无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已知成分组配的不加血清的合成培养基，通常在含有细胞所需营养和贴壁因子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞良好生长，是最适合于制药生产的培养基。它提高了培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦：血清中某些细胞毒性成分，血清中存在病毒、真菌、支原体等微生物污染的危险，血清中蛋白对产物蛋白测定的干扰。产品纯化容易，组分稳定，可大量配制。已有各种无血清培养基上市。

一些合成培养液可以作为无血清培养液的基础，如CMRL 1060、TC199、IMDM、McCoy 5a、Ham’s F10和F12。已有其他商品化的无血清培养液，如淋巴细胞无血清培养基、内皮细胞无血清培养基、杂交瘤细胞无血清培养基、巨噬细胞无血清培养基等。

无血清培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等，主要包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、腐胺、转铁蛋白。对于大规模生产用的无血清培养基，往往成分不完全清楚，但简单而且低成本。

4.3.3 动物细胞培养基的控制

4.3.3.1 培养用水质

细胞培养水质最低要求电导率在1×106 Ω cm以上。水存放时间不宜超过2周。对于制药，必需使用纯净水配制培养基，普通水必需除去各类元素、有毒或有害物质及微生物，还必需除热源，达到纯净水标准。

4.3.3.2 缓冲液

缓冲液(buffer solution)为弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成的，pH恒定但不干扰培养。常用的碳酸氢钠/碳酸（NaHCO3/H2CO3）、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(Na2HPO4/NaH2PO4)缓冲体系，调节二者的比例，配制成不同pH缓冲液。一般要求体外培养缓冲液pH为7.2～7.4，满足动物细胞生长的最适pH。

最广泛使用的缓冲液为盐离子缓冲液NaHCO3/H2CO3，其次为Na2HPO4/NaH2PO4。碳酸盐缓冲液除了直接的缓冲作用外，还有间接作用，碳酸生成挥发性CO2后很快逸出。细胞呼吸产生的CO2与水形成碳酸，在培养液中的任何碱都被中和，生产相应碳酸氢盐。碳酸氢钠在37℃时的缓冲能力为pH7.0～7.5，如果培养液pH超出此范围，就不能维持pH稳定性。而CO2的逸出，增加培养液的碱性。因此，在开瓶培养时，需要供应5％～10％ CO2和95％～90％空气，以平衡培养液中的CO2。

4.3.3.3 生理盐水与平衡盐溶液

缓冲液或缓冲盐溶液多用于配制一些与活细胞经常接触的溶液或培养后进一步处理细胞的溶液，如培养物的洗涤液等。对于直接接触、长期培养的培养液，常用生理盐水和平衡盐溶液，是渗透压与胞浆渗透压平衡的溶液。

最简单的生理盐水为0.9% NaCl溶液，为等渗溶液。现在有各种不同成分的生理盐水，分别加入pH缓冲剂与指示剂、葡萄糖等，形成了平衡盐溶液。

平衡盐溶液（balanced saline solution, BSS）是集缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗能力、营养供给为一体，具有多种功能和作用。在平衡盐溶液中，加少量酚红（phenol red），作为酸碱指示剂。溶液变酸时呈黄色，变碱时呈紫红色，中性时为樱桃红色，肉眼可检测pH的变化。

4.4 动物细胞的培养技术

4.4.1 细胞生长的基质依赖性

4.4.1.1 细胞对基质的依赖性

根据细胞的生长特性和对基质的依赖性，可分为贴壁依赖性细胞（anchorage-dependent cell）和非贴壁依赖性细胞（anchorage-independent cell）。

贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子(attachment factor)，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于此类，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。

接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后，就不再生长了，但仍然能存活一段时间。

非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，所以也被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于此类。有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在一定条件下，也可以悬浮生长。如CHO细胞、小鼠L929细胞、BHK细胞等。

4.4.1.2 生长基质

贴附细胞生长需要一个支持介质，培养器皿表面的材质不适合，因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞的贴附和生长。把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质称为生长基质（growth substratum）。生长基质一般为胞外基质成分，这里主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等，其他载体材料见相关节。

多聚赖氨酸（poly-lysine）是合成的赖氨酸多聚体，分子量为7～30 ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。纤维连接蛋白（fibronectin）是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子，具有维持细胞结构、促进贴附功能。层黏蛋白（laminin）为胞外基质中分子量900 ku的非胶原性糖蛋白，影响细胞的贴附和运动，调节细胞生长和分化。韧黏素（tenascins）是六聚体糖蛋白，分子量190～230 ku，具有促进肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞贴附的功能。层粘蛋白（vitronectin）是多聚体糖蛋白，分子量65～75 ku，具有促进细胞、血小板的黏附、激活补体和纤溶酶原活性等功能。

生长基质已有商业化产品，用PBS或BBS配成10倍贮存液，在37℃下包被，静置2～4小时或室温过夜，对器皿表面进行包被，然后无菌生理盐水洗涤后使用。有些还可以直接加入培养液。

4.4.2 动物细胞系的获得与保存

4.4.2.1 原代细胞培养

目前用于制药的动物细胞有4类，即原代细胞系、二倍体细胞系、异倍体细胞系和融合的或重组的工程细胞系。

原代细胞系是直接用动物组织或器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬浮液。用1g组织获得的真正能满足生产的细胞只是一少部分，因此用原代细胞系生产药物需要大量的动物。

培养原代细胞需要自己制备，基本过程如下：处死动物后，在无菌条件下，取出组织并破碎，加入Hanks缓冲液，洗涤，低速离心，弃上清。用酶于37℃消化，轻摇，把组织分散成单细胞。用缓冲液洗涤，如果有大块组织，再过滤。加入培养液，制成一定浓度的细胞悬浮液，细胞计数，检查消化是否充分和完全。接种到培养基，进行培养。所用消化酶一般为胰蛋白或胶原酶，前者用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾及传代细胞等，时间30～60分钟；后者适宜于纤维组织、上皮组织、癌组织等，常用BSS和含血清的培养基配成0.1～0.3 mg/ml的工作浓度，消化时间长根据具体情况而定，数小时至过夜。用于消化组织的酶还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，可根据具体情况使用。

4.4.2.2 传代细胞培养

二倍体细胞系是原代细胞经过传代、筛选、克隆等从多种细胞中纯化并具一定特征的细胞系。是典型的正常二倍体细胞，有限生长，无致瘤性，一般从动物胚胎组织中获取。曾经广泛应用，但不是理想的生产细胞系。

传代是指对长满器皿表面的细胞进行分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期，过早产量低，过晚细胞健康状态不佳，因此要掌握好最佳时期很重要。基本过程与原代细胞分离和培养相同，用30～50倍体积的0.25％胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀，生长速度一致的传代细胞。也可以用微囊载体进行传代培养。

4.4.2.3. 细胞系的保存

一旦获得了稳定的有一定特征的细胞系，无论传代细胞系还是工程细胞系，就要建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产的有关规定，必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库。动物细胞系常用低温冷冻方法进行保存。用冷冻保护液（含10％血清的培养液，附加10％甘油或7.5%～10%二甲基亚砜）将细胞预冷，稀释成2×106～5×106细胞/ml。按1ml/安瓿瓶分装，火焰下封口。放入慢冻机内，以1℃/min速度缓慢冷冻，至－25℃。如果长期保存，在液氮中聚苯乙醛制成的塞子控制冷却，小心操作，避免冻伤。冷冻好的细胞放入CO2低温冰柜或液氮中，温度为－150～－190℃，细胞的全部活动几乎处于停止状态。

如果要复苏细胞，将冷冻细胞取出，立即在37℃水浴中，快速融化。在保护剂存在下，慢冻快融是保存复苏细胞的要领。融化后的细胞可用于进一步实验。

4.4.3 大规模培养方法

根据动物细胞的生长特点，只能采用悬浮培养、贴壁培养、固定化培养三种主要方法进行大规模培养。

4.4.3.1 单层贴壁培养

单层贴壁培养（monolayer anchoraged-dependent culture）是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上进行的单层培养方法。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。接种后，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面，然后进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。一般数天就长满整个表面，形成致密的单层细胞。最后，贴壁培养的细胞会形成二种形态，成纤维样型细胞（fibroblast-like cell type）和上皮样型细胞(epithilium-like cell type)。

单层贴壁培养必须根据细胞数目和培养液的体积，增加基质表面积。实验室研究培养常用多孔平板（multiwell plate,如96孔、6孔等）、培养瓶（flask,如25ml、100ml等），进行静止培养(static culture)。动物细胞大规模培养常用容器主要有转瓶（roller bottle）或转管(roller tube)、玻璃珠、微载体和中空纤维等。

细胞黏附在固体表面主要力是静电引力和范德华力，因为动物细胞在生理状态下带负电，贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高度表面活性。适宜的电荷密度是黏附和贴壁的关键，电荷密度低，不能有效黏附，电荷密度高则会对细胞产生毒性。

转瓶是早期培养所采用，现在仍用于疫苗等生产。转瓶结构简单，投资少，经济实用，可做成支架，大量培养，收获细胞或培养液方便，重复性好，容易放大。非贴壁细胞处于悬浮状态，而贴壁细胞则在瓶内壁上贴附生长形成单层细胞。主要优点是比表面积增加，处于衡态转动，增加气体交换。但转瓶的劳动强度大，占用空间体积大，产量低，不易控制和监测培养环境变化。转瓶的空间变化较大，在500～1800 cm2之间，塑料瓶一般一次性使用，而玻璃瓶可重复使用。有时细胞在贴壁之前会发生集聚，可将转速进一步降低到2～5转/小时。选择适宜的血清或表面包被聚赖氨酸等，能克服集聚现象。

贴壁培养的优点是容易更换培养液，在灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。其缺点是操作较烦杂，细胞生长的检测受到一定限制，培养条件难以均一，传质和传氧差，放大培养是瓶颈。

4.4.3.2 悬浮培养

悬浮培养（Suspension culture）是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程,主要对于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的，经常借鉴发酵理论和经验，但有自身的特点，由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切，对环境适应性差。在培养过程中与微生物发酵培养不同，在悬浮培养中要注意发挥动物细胞的特性。常用的反应器有通气式搅拌混合气升式生物反应器。方法的优点是操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标记而降低免疫能力。

4.4.3.3 固定化培养

固定化培养（immobilization culture）是将动物细胞包埋在微载体内或胶囊内，即细胞固定化后，进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有细胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等优点，是生产首选方法。细胞固定化是在酶固定化基础上发展起来的，固定化的方法有多种，对于特定情况，必须合理选择。

吸附法(adsorption method)是通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面的一种固定化方法，如微载体培养和中空纤维培养等。虽然吸附法的操作过程简单，但由于相互作用弱，细胞容易从载体上脱落。

包埋法(entrapment method)是将细胞包埋在载体内部的一种固定化方法，分为网格型和微囊型两种。网格型的载体为高分子凝胶细网格，而微囊型的载体为高分子半透膜，直径为几至几百微米，比网格载体小得多。包埋细胞的高分子材料有人工合成的聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等。包埋细胞的材料可以是人工合成的高分子聚合物、多糖和蛋白质类，最常使用的是海藻酸盐包埋非贴壁细胞和胶原包埋贴壁细胞。包埋的机理是通过物理作用而实现的，如1％～2.5％琼脂糖在高温加热下融化，低于45℃～37℃凝固，与细胞混合，分散在石蜡油中，降低至10℃，得到0.1～0.3 mm微球。海藻酸钠为液体，与细胞混合后，滴到氯化钙溶液中，钙的介入凝固，形成1 mm微球。凝血酶的加入可使血纤维蛋白对细胞的包埋。

4.4.3.4 微囊法培养

微囊法（microencapsulation method）是用亲水半透膜把细胞包埋在微囊中的一种固定化方法。使用较多的是多聚赖氨酸/海藻酸固定细胞。凝胶载体的表面被长链氨基酸的聚合物如多聚赖氨酸覆盖形成一层坚韧多孔可透薄膜，再使凝胶载体液化，便可制成微囊。杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合，经微囊发生器，微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，再用柠檬酸去钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞在微囊内悬浮。微囊形成一种微环境，降低了剪切力，细胞生长良好，实现高密度培养。微囊化固定培养工艺在单克隆抗体的生产中获得成功，使抗体截留在膜内，血清中的蛋白质被排出在膜外，产物浓度和纯度较高，培养结束后，收获微囊，破微囊后，纯化抗体，纯化工艺简单，应用前景广。

Van Wezel于1967年开发了DEAE-Sephadex A-50的微载体系统培养贴壁细胞，细胞贴附于微载体上进行伸展和增殖，再悬浮于培养液中。微载体（microcarrier）培养兼具有贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的比表面积，供单层细胞贴附和增殖，悬浮微球（microbead）使细胞生长的环境均一，能很好检测和控制。培养基利用率高，重复性好，减少了劳动强度，容易放大，于20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。以后，人们又研发了多孔微载体或多孔微球，极大的增加了比表面积，如Cytodex-1的比表面积达6000cm2/g，多孔微球cytopore的比表面积达2.8 m2/g。商品化的微球基质是玻璃、葡聚糖（dextran）、纤维素、塑料和明胶等，带电基团为DEAE等。

微载体的直径约60～250μm，但对于动物细胞培养经常控制在100～200μm之内。理想的微载体应该具备以下性能：质地柔软，微球间的摩擦轻；耐高温120℃，可高压灭菌；透明性，可直接在显微镜下观察细胞生长情况；细胞相容性，利于细胞贴附和生长；无毒性和惰性，对细胞本身无毒害作用，也不产生有害物质，不吸附培养基的成分；比重较低，为1.02～1.05 g/ml，低速（40～50 r/min）即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获；微粒大小均匀，可回收重复使用。

4.5 动物细胞培养过程的检测与工艺控制

有些参数的检测与工程菌发酵相似，这里主要对不同之处进行阐述。

4.5.1 细胞活性与形态检测

培养细胞要先制成悬浮液，计数后，再按一定浓度接种培养。一般用血球计数板对细胞在显微镜下进行计数，在细胞计数的同时，还必须检查细胞的存活性，才能准确计算出相应的活细胞浓度。组织化学染色法是常用的检测细胞活性的方法，可对细胞进行台盼蓝活体染色，死细胞染成蓝色，而活细胞不着色。其它色素如苯胺黑、结晶紫等染色测定细胞活性。细胞形态的观察也是在显微镜下进行的，活力良好的细胞，轮廓不清，透明度大，反之，活力低的细胞，轮廓可见，细胞质中出现空泡、脂质体和其它颗粒，细胞形态不规则，失去原有的特性，如上皮细胞变成纤维细胞。

在生长过程中，每隔几天要对细胞进行检查，内容包括是否污染、形态变化、活性变化等。动物细胞培养中污染的主要来源是培养基包括血清和培养用液，操作不慎带入空气中的微生物也是常见的污染来源。在发生霉菌污染时，会出现大的菌落，肉眼可见；但对于细菌污染，只有在严重情况下才会引起培养基混浊。因此常用肉汤培养基于37℃恒温培养，检查是否有细菌污染。类胸膜肺炎生物体（Pleuropneumonialike organism, PPLO）的污染也较常见。由于PPLO只有0.25～1 μm，无细胞壁，污染后，细胞仍能生长，甚至无明显变化，因此常常不易发觉。支原体的污染源不清楚。支原体（mycoplasmas）污染后，有时使细胞发生不同程度病变，导致培养失败，甚至可造成严重后果。支原体分解主要营养物质，干扰某些病毒生长；促进二倍体细胞老化。用污染细胞制备血清抗原和免疫血清时将产生混乱。对于病毒制剂，由于含有支原体抗原，使之不能使用。而且支原体与病毒可能被混淆。

4.5.2 培养基成分检测与代谢控制

4.5.2.1 基质消耗的检测

营养消耗和代谢废物及目标产品积累的监测是检测的主要内容。营养的消耗可以用葡萄糖的减少为指示，而产物的积累可以用乳酸和铵的增加作为指示，动态检测这两种物质的变化，就能反应细胞的生长和代谢过程，从而判别细胞的状态是否正常。

在分批式培养中，葡萄糖的起始浓度一般为5～25 mM，谷氨酰氨的起始浓度为2～6 mM。在杂交瘤细胞培养的终点，乳酸的最终浓度将是葡萄糖起始浓度的1.7倍，氨离子浓度为2～4 mM。铵离子和乳酸是细胞代谢的副产物，将抑制哺乳动物细胞的生长。丙氨酸是很多的细胞的代谢副产物，但一般认为对细胞没有毒害。铵盐很容易积累达到1～5 mmol/L，就降低细胞生长速率。铵离子干扰了电位梯度、胞内pH改变和凋亡，铵的无效循环增加了维持细胞的能量负荷。铵还对蛋白质产物的糖基化产生严重的影响。乳酸的影响主要是分泌进入培养液，改变了培养的pH环境。在自动控制的生物反应器内，乳酸的浓度很少达到毒害水平（约60 mmol/L）。

对于固定化床和中空纤维反应器，不可能直接获得细胞，因此细胞技术和生物量检测就很困难。可以用NMR分析培养空间的成分。把细胞置于NMR中，产生特征图谱，从而鉴定和定量代谢产物。也可分析细胞的分布，甚至是区分增殖和非增殖细胞。

4.5.2.2 代谢控制

如果存在过量的葡萄糖，细胞将消耗90％以上葡萄糖作为乳酸分泌到培养液，即使在完全有氧条件下也如此。同样，流加过量的谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门冬氨酸的积累。代谢副产物乳酸和铵离子会抑制动物细胞的生长。药物生产使用的动物细胞系一般都是连续细胞系，对细胞增殖失去了控制。与此同时，遗传突变增加了细胞对葡萄糖和氨基酸的消耗。细胞代谢流加快才能满足细胞的快速生长。

限制葡萄糖的流加量，将减少乳酸的总量，也减少由葡萄糖直接生成乳酸的量，增加葡萄糖的产量系数。在葡萄糖限量时，大部分葡萄糖主要用于氧化和生物合成，这与微生物的情形类似。限制谷氨酰胺的流加量，同样可减少铵盐和氨基酸的生成。如果进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和铵离子将同时减少。通过葡萄糖和谷氨酰胺控制使细胞代谢变得更有效。在生产工艺中，优化二者之间的关系，使之代谢协调起来，对生产过程显得十分重要。

在代谢控制中，有必要检测细胞的活力、ATP、DNA和蛋白质的含量，和生物量或细胞计数、底物和产物代谢变化的相结合，评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。

4.5.3 溶解氧的检测与控制

培养基中的溶氧水平直接影响细胞的代谢。低氧水平阻碍细胞代谢，而过高氧浓度下，细胞会产生氧自由基，对细胞造成伤害。在细胞的生长过程中，要严格控制培养液中的溶解氧。不同动物细胞类型对溶解氧要求不同，一般而言，动物细胞对氧的消耗速率为0.006～0.3 μmol/106细胞小时或2.4mg/106细胞天或4.5～4.8×10－12g/cell.h。大部分细胞在较大的氧压范围（15％～90％DO）内生长良好。耗氧率受细胞类型、细胞密度、培养的增殖率、葡萄糖浓度以及谷氨酸盐浓度的影响。耗氧速率在一定的溶氧浓度范围内可近似为一常数，但氧分压低于5～10mmHg时，摄氧速率会减小。一般而言，动物细胞对氧的比消耗速率为0.003～0.5 μmol/106细胞.小时,CHO的耗氧比速率为0.15，BHK-21为0.2，鼠杂交瘤为0.03～0.48。

根据生物反应器内的氧平衡原理，供氧方式必须保证氧浓度高于临界氧浓度，提高氧传质系数、传质面积、传质动力都能改善供氧。大规模生物反应器必须直接鼓泡通气或使用膜通气。在摇瓶或转瓶培养时，只有保持瓶内足够的空间，不超过三分之一体积的培养液，就能通过液面交换气体。

在搅拌罐反应器和鼓泡反应器中，常使用剪切保护剂以保护细胞。在高鼓泡速率下，0.1％～0.2%(w/v)的非离子表面活性剂（聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物）、F－68（BASF）对杂交瘤细胞具有很强的保护作用。为防止鼓泡生物反应器中形成泡沫，可用浓度为6—100 ppm的硅消沫剂，而且在这个浓度范围对细胞生长几乎没有影响。鼓泡塔式生物反应器的通气速率为1VVh，喷气搅拌式生物反应器的搅拌速率为0.1-1VVh。较低通气速率可降低消沫剂和剪切保护剂的使用量。

在大规模生产中，反应器设计都有溶氧检测装置，可直接读取。根据不同细胞类型的最适溶氧水平不同，通过向培养液中加入不同比例的氧气、空气或氮气或二氧化碳来控制溶氧量， 溶氧量的控制常常与pH值控制结合在一起，根据需要使用。

4.5.4 pH值检测与控制

动物细胞培养基呈偏碱性，常给培养基中加入微量酚红指示剂，根据指示剂颜色的变化，可以直观显示培养基pH变化。在开始培养时，培养液pH为7.4。在培养过程中，由于随着细胞浓度的增加，产生了较多的CO2和乳酸，pH会下降，但必须控制不能低于pH7.0。精确控制pH非常重要，一般为6.7～7.9,其波动范围为0.05～0.9。虽然很多杂交瘤细胞最佳pH为7.0左右，但下降在6.8时，会抑制生长。

在大规模培养中，有pH计能随时检测。直接加酸或碱不适合动物细胞培养。常用碳酸氢盐缓冲剂，通入CO2来调节pH。培养基中pH值取决于CO2和碳酸氢盐的浓度比，加入CO2可降低pH值，加入碳酸氢盐可提高pH值。但碳酸氢盐缓冲液的缓冲能力弱，安全的作法是通过控制溶氧量间接控制pH值，但增加溶氧量会使培养基中CO2被置换出来，导致pH值升高。因此应该合理配置，从而达到控制的目的。

4.5.5 温度检测与控制

动物细胞对温度变化很敏感，对温度控制要求十分严格。采用高灵敏的温度计（灵敏度为±0.25℃）来在线检测，将温度控制在误差为0.5度的范围内。根据温度探针，进行反馈控制，可采用预加热培养基，或加热周围的水套层，使温度恒定。

4.5.6 搅拌剪切检测与控制

搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高了氧及其他营养物质的传递速率。但搅拌产生剪切力会对哺乳动物细胞造成损伤。过度搅拌引起的细胞损伤可用悬浮培养中的胞外蛋白浓度来表征，它决定了细胞的裂解程度。最常用的是细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH），在指数生长阶段，细胞内LDH水平是一常数。在不同搅拌条件下，通过监测LDH的增加来评价细胞损伤程度。

搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构有关，不同生物反应器产生不同的细胞应力。细胞承受的机械应力取决于搅拌桨设计及其直径和转速、罐体设计及其直径以及液相的比例。

4.5.7 目标产物的检测与控制

生产过程中也要对细胞分泌的目标产物进行跟踪检测，这可根据目标产物的性质，采取各种免疫方法进行测定，判断细胞是否在有效地合成并积累目标蛋白质。

动物细胞培养的产物并非100％具有生物活性，它取决于糖基化完整性和蛋白酶的降解程度。细胞生长的环境对它影响很大，包括培养方式、生长时期、葡萄糖和氨离子浓度及其它培养液的成分和pH、氧浓度等。选择适宜的生理状态对获得糖基化正确的蛋白质产物非常重要。

很多因素影响蛋白质产物的产量，可用比生产速率表征，提高生长速率对增加产量有积极作用。动物细胞的产物浓度通常用占总蛋白的百分数或用一定细胞数目的产物量表示。非培养液成分能增加比生产速率，有报导渗透压从正常的330升到400，提高了比生长速率。另外，添加丁酸也能提高比生长速率，可能是丁酸使细胞滞留在G1期。骨髓瘤细胞系生产重组抗体，生长速率从0.016增加到0.042，生产速率从18％提高到29％。

4.6 重组人红细胞生成素生产工艺

4.6.1 红细胞生成素概述

4.6.1.1 红细胞生成素的种类

红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对红细胞生成的特异性刺激作用的细胞因子。红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。肾功能受到损害，如慢性肾衰竭的病人，红细胞生成素的产生受阻，可导致贫血。正常人体内血液中红细胞生成素的含量为10～18 mU/ml。当体内缺氧时，红细胞生成素的含量可提高到1000倍以上。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞的特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中释放红细胞。

天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。根据种属不同可分为人红细胞生成素、小鼠红细胞生成素、猴红细胞生成素等。目前已知人红细胞生成素有两种存在形式，即人EPO-α及人EPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，都含有165个氨基酸残基。分子量、等电点及生物活性也都类似，差别在于二者的糖型组成不同，EPO-α含有较多的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，总的含糖量也较EPO-β高。

　 重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活基本相当。同天然人红细胞生成素一样，基因工程人红细胞生成素依据糖基结构的差异也可分为α、β两种，即rhEPO-α和 rhEPO-β。

4.6.1.2 红细胞生成素的临床应用

红细胞生成素的促进红细胞生成作用已得到大量动物实验和临床实验的证实，主要作用于红系集落生成单元（CFU-E），通过与CFU-E中的红细胞生成素受体结合而加速CFU-E的分化和增殖，促进其产生红细胞，维持外周血的正常红细胞水平。

已获批准的适应症主要有肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。除以上已获批准的适应症外，红细胞生成素尚有潜力用于自体供血、术后贫血、早产儿贫血、骨髓移植、再生障碍性贫血、类风湿关节炎患者贫血、骨髓增生异常综合症患者贫血、镰刀形红细胞性贫血、地中海贫血等。

自从1989年FDA批准红细胞生成素[Amgen公司Epogen、Ortho Biotech公司Procrit] 用于临床连续治疗需要透析的慢性肾衰病人以来，很多国家也已经批准红细胞生成素上市和生产。

重组红细胞生成素(EPO)是目前临床上治疗慢性肾衰性贫血疗效最显著的生物技术药物。销售额一直排在生物医药类产品的前三名，每年的增长率在10％以上，2000年，红细胞生成素的全球销售额达到了42亿美元。

4.6.1.3 红细胞生成素的物理化学性质

成熟的红细胞生成素是由165个氨基酸残基组成的糖蛋白，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳）。红细胞生成素前体带有27个氨基酸的信号肽。红细胞生成素基因存在于7q11-q22区的一个5.4 kb HindⅢ-BamHⅠ性内切酶切片段中。

用沉淀平衡法测定红细胞生成素分子量为34 kD，其中肽键部分从其氨基酸组成序列推算为18398D，据此推测其糖链占分子量的39%。圆二色谱表明人红细胞生成素的肽链骨架50％为α-螺旋，其余为无规则卷曲结构，其中两个反平行的α-螺旋组成类似于生长激素的结构。红细胞生成素分子中糖键结构也已明确。126位O糖链的主要组成为N-NeuNAC α-2→3Gal β1→3 (NeuNAC α-6) Gal NAcOH－丝氨酸。各种N连接寡糖链结构占总含糖量的百分率分别为：双末梢糖链1.4%，三末梢糖链10%，带有一个N-乙酰氨基半乳糖重复单位的三末梢糖链3．5%，四末梢糖链31.8%，带有一个、两个和三个N-乙酰氢基半乳糖重复单位的四末梢糖链分别为32.1%，16.5%和4.7%。所有这些寡糖链都被以α2→3连接方式唾液酸化了,其中四末梢糖键被2个或3个唾液酸残基唾液酸化。另外还发现天然和重组人红细胞生成素仅唾液酸含量有微小差异，其它糖键结构并无不同。未经O糖基化的重组人红细胞生成素的体内外活性及体内清除速率与完全糖基化的红细胞生成素无差别，N糖基化不完全的重组人红细胞生成素体外活性正常，而体内活性则降低到体外活性的1/500，其体内被清除的速率也明显加快。糖基化红细胞生成素对热和pH变化稳定，等电点为4.2～4.6，未经糖基化肽链等电点pH为9.2。

4.6.1.4 红细胞生成素的表达研究

早期，人源的红细胞生成素由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，但这种方式获得的红细胞生成素产量极其有限，无法满足临床及科研的需求。重组DNA技术的发展，为大量生产人红细胞生成素提供了一条新的途径。

Jacob等从基因文库中克隆并测序了编码红细胞生成素的DNA片段，同时，以核酸探针从λ噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Lin等(1985)由人基因组中获得编码红细胞生成素的基因，将其转入中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）中，获得稳定的表达。

Quelle等利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。虽然经转化的SF9细胞生产的rhEPO的产率有所改善，但是目标产物rhEPO的糖基化程度较天然红细胞生成素为小，因而其分子量亦较小。Mori等人构建了一个含有干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，并利用该rhEPO表达载体转化B细胞白血病BALL-1细胞。经以仙台病毒转染后，转化的B细胞白血病BALL-1细胞比现有技术所得的转化株能产生较高量的rhEPO。

重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。至于家蚕体内的表达系统，也存在糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。

4.6.2 表达红细胞生成素的细胞系

基因工程人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中的表达主要过程如下。

4.6.2.1 构建红细胞生成素表达载体

有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。

将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。

构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。

4.6.2.2 构建表达红细胞生成素的细胞株

以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。将此细胞培养于100 mm培养皿中，待细胞长满至50%～60%时，用无血清细胞培养基淋洗细胞，加入由无血清培养基、表达载体和共转化载体，以及lipofectin组成的共转染混合液，37℃培养4小时。吸出培养基，加入含10%胎牛血清的F12培养基，37℃培养过夜。随后在含青霉素、链霉素及10%胎牛血清的DEME中培养，获得抗性克隆。逐步提高MTX终浓度，筛选抗性克隆。利用酶联免疫分析法确认所得到的细胞表达人红细胞生成素。

4.6.3 CHO细胞培养工艺过程

在获得了能够高效表达目的蛋白的重组细胞株以后，需要解决的问题就是通过培养而大量生产出目的蛋白。常规动物细胞培养的方法是将细胞放在不同的容器中进行培养。如利用转瓶大量培养贴壁细胞或用生物反应器培养贴壁或悬浮细胞。

转瓶培养细胞工艺简单，规模易于扩大，污染易于控制，一直用于疫苗工业的生产，是传统的细胞培养生产工艺。美国Amgen公司是世界上最早获得人红细胞生成素生产和上市的企业，采用的生产工艺即是转瓶培养生产工艺。以下介绍生物反应器培养工艺。

4.6.3.1 种子细胞制备

（1）冻存的细胞株37℃水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。

（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。

（3）37℃二氧化碳培养箱培养，连续传三代。

（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5×106个/ml。

6.4.3.2 反应器连续培养

（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。

（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速<50 r/min，37℃，DO 50%～80%，进行贴壁培养。

（3）转速提高到80~100 r/min，继续扩增培养10天。

（4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。

（5）收获培养物，4℃~8℃保存。

4.6.3.3 培养工艺控制

生物反应器由于各种辅助配件比较完善、因此具有许多优点，如无菌操作安全可靠、保温和气体交换可靠，能保持pH值稳定，监视控制自动化，产物的收集和新液的补充持续进行以及载体有足够的表面积等，非常适于基因工程细胞的高密度、高表达连续培养。但不同的细胞，其最适生长和表达条件不完全相同，必须摸索出最适培养条件。

在刚接种后细胞稀少时，搅拌速度缓慢，使细胞牢固地贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度，以便使细胞周围的微环境中代谢产物和营养物质都在较短的时间内达到平衡。

动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。因此，对温度的控制应较为严格。恒定的温度(37℃)及pH值(7.2)也是较为理想的条件。

pH值也是细胞培养的关键性参数，它能影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适pH值因细胞类型不同而异，应先通过实验寻找出最适pH值，再通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。细胞生长与表达的pH值为7.0~7.2。

氧是细胞代谢中最重要的养分之一。它可以直接和间接地影响细胞的生长与代谢。溶解氧应在10％~100％的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气按比例的混合气体以控制溶氧。

葡萄糖是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度，细胞生长、表达旺盛时，需大量消耗，而缺乏时细胞生长速度与产物表达量均降低，故应及时充分地予以补充。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。

虽然采用有血清培养基有效刺激细胞的分化和增殖，但无血清的合成培养基用于生产，可降低纯化过程中杂蛋白质的含量，减少纯化的负载，并延长层析色谱柱使用寿命，有效提高产品的纯度。

4.6.4 红细胞生成素的分离纯化工艺过程

4.6.4.1 红细胞生成素的初级分离

①CM－Sephrose亲和层析柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡缓冲液平衡。

②收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。

③0～2 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。

④收集活性洗脱峰10 mmol/L Tris透析液透析过夜。

4.6.4.2 红细胞生成素的精制

①透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。

②0～1 mol/L NaCl- Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。

③上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱（C4填料），10%～70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。

④上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。

在透析过程中，透析液的体积为蛋白液的15倍体积，过夜，并分四次换液。在上离子交换柱前用0.22 μm滤膜过滤。在上RP-HPLC柱前样品蛋白含量为0.37 mg/ml，经无菌过滤后制成粗品再进一步纯化。在上凝胶柱前蛋白含量约为1.0 mg/ml，最后得到产品蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活>1.2×105 IU/mg。

4.6.5 红细胞生成素的质量控制

4.6.5.1 红细胞生成素的活性检测

得到红细胞生成素纯品后，测定纯度、蛋白含量、分子量等物理化学性质和体内生物学活性。

红细胞生成素的体外活性即免疫学活性，用酶联免疫分析试剂盒检测。试剂盒内含有标准重组人红细胞生成素。将待测品稀释后，进行酶联免疫分析，依照其OD值，以内标法计算样品相对于标准品的活性。

红细胞生成素的体内生物活性测定：采用网织红细胞计数法。选用6－8周龄的同性别 BALB/c小鼠分为三个计量组，每组两只。分别于腹部皮下注射红细胞生成素标准品和稀释样品以2IU/只，4IU/只,8IU/只剂量注射；连续注射三天后，眼眶取血，染色，涂片计数1000个红细胞中的网织红细胞数，同时也计算原血中的红细胞数，两值相乘为原血中网织红细胞绝对数。以注射剂量为横坐标，网织红细胞绝对值为纵坐标，求得待测样品的体内生物学活性，并计算样品稀释前的浓度。

4.7 单克隆抗体生产工艺

4.7.1 概述

4.7.1.1 抗体

抗体是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能免疫的球蛋白，它与免疫球蛋白的区别在于，抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性功能。所以抗体是一个生物学和功能性概念，而免疫球蛋白是一个结构性概念。除抗体之外，还包括正常天然存在的免疫球蛋白和病理条件下的免疫球蛋白及其亚单位。

19世纪末是通过免疫动物从血清中获得抗体，20世纪70年代建立了B细胞杂交瘤生产单克隆抗体技术即细胞工程抗体，80年代中期开始了基因工程人源化抗体的研究，90年代开始用抗体库技术筛选小分子抗体，并用原核细胞表达抗体，即基因工程抗体。抗体工程技术使抗体的应用超出了原有范畴，在疾病的诊断、检测和治疗中越来越显示出巨大的前景。

4.7.1.2 抗体的结构

Ig分子的特点使功能和结构的双重性：为了识别不同抗原，需要数量巨大的结构多样性；但在发挥体内效应时，需要结构的稳定性。虽然Ig分子是体内最复杂的分子，但具有相似的基本结构，其单体由2条相同的重链（heavy chain, H链）和2条相同的轻链（light chain，L链）组成的四聚体。

每条链分为两个区，可变区（Variabl region, V区）和恒定区（constant region，C区）。V区从多肽的N端起，包括轻链的1/2和重链的1/4，其氨基酸的序列变化较大，随抗体的特异性不同而不同。其中高可变区（Hypervariable region, HV区）或互补决定区（Complementary determining region, CDR）是抗原特异结合部位。C区从多肽的C端起，包括轻链的1/2和重链的3/4，同类抗体这部分氨基酸序列变化不大。重链约由450个氨基酸残基（IgG、IgA、IgD）或570个氨基酸残基（IgM、IgE）组成，分子量50～75 ku，重链糖基化。轻链由214个氨基酸残基组成，分子量25 ku，轻链无糖基化。Ig对称结构，轻重链之间和重链之间以二硫键连接，形成一“Y”字型结构。

根据V区抗原性的不同，对应的抗体是IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，它们的理化和免疫特性互不相同。轻链有两类κ和λ，分子量相同23000，由214个氨基酸组成。

4.7.1.3 抗体的分类

根据抗体的生产技术和发展，可把抗体分为以下三代。

第一代抗体为多克隆抗体（polyclonal antibody,），由早期传统的方法制备的抗体，把天然抗原经各种途径免疫动物，分离提取的免疫血清。由于抗原物质具有多种抗原决定簇，所产生的抗体是多种抗体的混合物。由于抗体不均一，临床应用受到限制。

第二代抗体为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)是由识别一种抗体决定簇的细胞克隆所产生的均一抗体。具有特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少的优点，应用于临床的抗肿瘤、抗感染、解毒、抗器官移植排斥反应等。第二代抗体主要形式有二种，全抗体和酶解片段抗体。如木瓜蛋白酶水解片段、胃蛋白酶水解片段等。一般用杂交瘤（hybridoma）的鼠生产，所以称为鼠源单克隆抗体。其缺点是有鼠源性，对人体有较强的免疫原性（immunogenicity）；半衰期短，靶向吸收差，全抗体分子量大，很难通过血管进入细胞，特别是肿瘤等部位含量低，降到了疗效。生产复杂，价格高贵。

第三代抗体是指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得的抗体。包括鼠源抗体的人源化，人鼠嵌合抗体，改型抗体，小分子抗体。

小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗体分子片段，是近几年的研究热点。根据抗体的各个结构域功能进行构建，可分为Fab抗体，单链抗体、单域抗体和超变区抗体。具有以下优点：可以在大肠杆菌等细胞中原核表达，生产成本低；容易穿透血管壁或组织屏障，进入病灶部位，有利于治疗肿瘤等；不含有Fc片段，不与Fc受体结合；有利于进一步进行基因工程改造。

4.7.2 鼠源单克隆抗体制备

鼠源单克隆抗体是用动物鼠来生产的，先制备鼠杂交瘤细胞系，然后在体内或体外生产抗体。杂交瘤杂交瘤细胞系的制备工艺包括免疫动物、亲本细胞的制备、细胞融合、培养筛选与鉴定、克隆化等过程。

免疫的B淋巴细胞分化为浆细胞，是产生特异性抗体的细胞，但浆细胞还不能在体外培养基中成功生长，因而不能成为体外生产抗体的来源。骨髓瘤细胞（myeloma cell）虽然能在培养基中生长且比正常细胞生长繁殖速度快，但不能产生抗体。将这二种功能细胞进行融合，就可把免疫淋巴细胞具有特定抗体基因的染色体引进至一种长期生长的骨髓瘤细胞，这样所得到的杂交瘤细胞，既具有体外长期迅速增长的能力，又能持续产生和分泌特定单一成分的特异性抗体。

4.7.2.1 杂交瘤细胞系的制备

（1） 制备B淋巴细胞

用目的抗原，按照免疫程序，对纯系健康8周龄的BALB/c小白鼠进行免疫，分离B淋巴细胞。

（2）原生质体融合

用1000~4000的聚乙二醇（polyelhylene glycol, PEG）为细胞融合诱导剂。取生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞悬液与新鲜制备的BALB/c淋巴细胞悬液，置于37℃水浴中，加入PEG4000（pH7.2～7.4），进行细胞融合。沿管壁加入DMEM或RPMI-1640培养液，终止其诱导作用。

（3）杂交瘤筛选与克隆化

在两类细胞的融合混合物中存在五种细胞，未融合的单核亲本细胞、同型融合多核细胞、异型融合的双核和多核杂交瘤细胞。从中筛选纯化出异型融合的双核杂交瘤细胞是目的。未融合的淋巴细胞在培养过程6～10天会自行死亡，异型融合的多核细胞由于其核分裂不正常，在培养过程中也会死亡，对杂交瘤细胞影响不大。但未融合的骨髓瘤细胞因其生长快而不利于杂交瘤细胞生长和分离。

经反复克隆化培养获得抗体阳性杂交瘤细胞株后，应立即扩大培养。冻保存液为含10％二甲亚砜的胎牛血清，杂交瘤细胞悬浮于胎牛血清中，浓度为5×106/ml，杂交瘤细胞悬浮液与冻保存液等体积混合，每安瓿瓶分装1 ml，在液氮中长期保存。

4.7.3 杂交瘤细胞的培养

目前单克隆抗体的生产包括体内培养和体外培养两种，体内培养是利用生物体作为反应器，主要是在小鼠或大鼠的腹腔内，杂交瘤细胞生长并分泌单克隆抗体，是目前商业用单克隆生产的主要方法。

先给BALB/c小鼠或与 BALB/c小鼠杂交的F1小鼠注射0.5ml异十八烷或液体石蜡使之致敏，8～10天后，向腹腔接种106～107杂交瘤细胞。2～4天后腹部涨大。1～2周时开始抽取腹水，隔日采集3～5 ml抽取腹水，直至动物死亡。也可在最大腹水时处死动物，一次性抽取腹水。另外还可用血清来生产单克隆抗体，将杂交瘤细胞皮下植入动物体内，一段时间后，出现肿瘤，采集血清制备单克隆抗体，一般血清中抗体的含量为1～10 mg/ml，但血清非常有限。体内法所产生的抗体滴度比体外悬浮法高1000倍，每ml腹水含单克隆抗体1～26 mg，一只小鼠可得10ml腹水，而大鼠可得50ml腹水。

体外培养法有悬浮培养、包埋培养和微囊化培养几种。小规模生产采用滚瓶或转瓶，大规模采用反应器罐。滚瓶培养先进行种子培养，逐级放大，但抗体浓度低，5～10μg/ml。发酵罐培养时，细胞密度增加，抗体含量为10～100 μg/ml。杂交瘤细胞的悬浮培养产生的抗体滴度较低，一般为5～100 μg/ml，细胞密度不高。培养基多用无血清，离心除去细胞，上清经超滤，盐析可得粗制品。包埋培养和微囊化是抗体生产的好方法。抗体被截留在微囊内，有利于分离纯化。细胞经过增长期生长之后进入稳定期，细胞密度为6×107/ml，抗体的处理和纯度随时间延长而增加，可生产抗体0.5～1 g/L，微囊内抗体纯度约50％，离子交换层析后可达99％。

4.7.4 单克隆抗体的分离纯化

收集到腹水或培养液上清，离心去除细胞等杂质，对上清进一步分离和纯化。通过离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法获得纯化的单克隆抗体。

（1）离心

将红细胞、细胞碎片及其它粒子如脂类、内毒素、核酸、等分离除去，澄清溶液。2000 g离心30分钟。加入硅胶及其他吸附剂，有利于分离。还可加入助滤剂，或切向流过滤。

（2）沉淀

收集细胞培养液，用硫酸铵沉淀，获得粗品。当硫酸铵的终浓度为饱和浓度的50％时，90％的单克隆抗体沉淀出来。对单克隆抗体浓缩和分离非常有效。通常采用辛酸—硫酸铵沉淀，亲和层析或硫酸铵-二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）离子交换层析获得单克隆抗体。

（3）纯化

根据抗体的亚型选用离子交换、Protein A-sephrose 4B 和Protein G-sephrose 4B亲和层析，羟基磷灰石分离、疏水层析。凝胶过滤等进一步纯化。

8.1 工艺设计图

工艺设计图是生产工艺设计的主要图纸，通常包括工艺流程图、设备布置图和管道布置图，一般应按不同设计阶段的要求和规定进行绘制。图样的种类及其主要表达内容可参考表8-1。其中设备图由设备专业人员设计绘制，工艺设计图则由工艺专业人员设计绘制。

表8-1 工艺设计图样及其内容

初步设计 施工设计 内容

工艺设计图

全厂总工艺流程图，物料平衡图 全厂总工艺流程，物料衡算结果

物料流程图 车间（装置）的物料流程，物料平衡，设备特征，换热器的热量平衡等

带控制点工艺流程图 带控制点工艺流程图，辅助管道系统图，蒸汽管系统图 车间（装置）或工段中的主辅管道、生产设备、仪表、管件、阀门的配制

设备布置图 首页图，设备布置图，设备支架图，管口方位图 车间（装置）、工段中生产设备、操作平台等的具体位置和安装情况，支架、平台的详细结构

管道布置图 管道布置图，蒸汽管布置图，管段图，管架图，管件图 车间（装置）、工段的管道、管件、阀门、管架及仪表检测点的位置，安装情况，管段、管件的详细结构

设备图

非定型关键总设备图 非定型总设备图及零部件图，设备总图，部件，零件的结构形式、尺寸、材质、数量、技术要求等

定型设备总图及零部件图 设备的主要结构形式、尺寸、技术特征

8.1.1 工艺流程图

工艺流程图是用来表达工艺生产流程的图样。一般有如下几种：

8.1.1.1 工艺流程示意图

工艺流程示意图是在生产路线确定后，物料衡算设计开始前表示生产工艺过程的一种定性图纸，有框图和流程简图两种表示方法，如图8-1所示的阿司匹林工艺流程方框图和图8-2所示的工艺流程简图。

8.1.1.2 全厂总工艺流程图或物料平衡图

总工艺流程图是为总说明部分提供的全厂总流程图样，有的工厂则改称为全厂物料平衡图。

8.1.1.3 物料流程图

工艺流程示意图完成后，开始进行物料衡算，再将物料衡算结果注释在流程中，即成为物料流程图。它说明车间内物料组成和物料量的变化，单位以批(日)计(对间歇式操作)或以小时计(对连续式)。从工艺流程示意图到物料流程图，工艺流程就由定性转为定量。

对应于工艺流程示意图，物料流程图也有两种表示方法:

① 以方框流程表示单元操作及物料成分和数量，如图8-3和8－4所示。

② 将物料衡算和能量衡算结果直接加进工艺流程示意图中，得到物料流程图，

8.1.1.4 带控制点工艺流程图

带控制点工艺流程图是表示全部工艺设备、物料管道、阀门、设备附件以及工艺和自控仪表的图例、符号等的一种内容较为详细的工艺流程图，也称生产控制流程图或工艺控制流程图。

8.1.2 设备布置设计

设备布置设计的最终成果是设备布置图等一系列图样，它包括：

(1)设备布置图 表示一个车间或一个工段的生产和辅助设备在厂房建筑内外安装布置

的图样。

(2)首页图 车间内设备布置图需分区绘制时，提供分区概况的图样。

(3)设备安装详图 表示用以固定设备的支架、吊架、挂架及设备的操作平台、附属的栈桥、钢梯等结构的图样(施工图设计内容之一)。

(4)管口方位图 表示设备上各管口以及支座、地脚螺栓等周向安装方位的图样(施工图设计内容之一)

8.1.3 管道布置图

管路的布置设计首先应保证安全、正常生产和便于操作、检修，其次应尽量节约材料及投资，并尽可能做到整齐和美观以创造美好的生产环境。

8.2 物料衡算

根据质量守恒定律，以生产过程或生产单元设备为研究对象，对其进出口处进行定量计算，称为物料衡算。

8.2.1 物料衡算的理论基础

物料衡算有两种情况：

① 针对已有的生产设备和装置，利用实际测定的数据，计算出一些不能直接测定的物料量。利用计算结果，对生产情况进行分析和判断，提出改进措施；也可用于检查原料利用率和“三废”处理情况。

② 为了设计一种新的设备或装置，根据设计任务，先作物料衡算，再经能量平衡求出设备或过程的热负荷，从而确定设备尺寸及整个设备流程。

物料衡算的基础是物质的质量守恒定律，即进入一个系统的全部物料量必等于离开系统的全部物料量，再加上过程中的损失量和在系统中的积累量。

式中 ΣG1──输入物料量总和；

ΣG2──输出物料量总和；

ΣG3──物料损失量总和；

ΣG4──物料积累量总和。

当系统内物料积累量为零时，上式可以写成：

根据上述定义可得到化学过程的物料衡算的基本关系式为：

进入反应器的物料量—流出反应器的物料量—反应器中的转化量＝反应器中的积累量

在化学反应系统中，物质的转化服从化学反应规律，可以根据化学反应方程式求出物质转化的定量关系。

8.2.2 确定物料衡算的计算基准及每年设备操作时间

8.2.2.1 物料衡算的基准

物料衡算的基准是：

(1)以每批操作为基准，适用于间歇操作设备、标准或定型设备的物料平衡，合成药物的生产以间歇操作居多。

(2)以单位时间为基准，适用于连续操作设备的物料衡算。

(3)以每公斤产品为基准，以确定原材料的消耗定额。

连续生产的原料药，在一定时间间隔内生产的在规定限度内的均质产品为一批；间歇生产的原料药，可由一定数量的产品经最后混合所得的在规定时间内均质产品为一批。

8.2.2.2 每年设备操作时间

车间设备每年正常开工生产的天数，一般以330天计算，余下的36天作为车间检修时间。对于工艺技术尚未成熟或腐蚀性大的车间一般以300天或更少一些时间计算。

8.2.3 收集有关计算数据

8.2.3.1 相关计算数据

为了进行物料衡算，应根据中试放大数据或生产操作记录，收集下列各项数据：反应物的配料比，原辅材料、半成品、成品及副产品等的名称、浓度、纯度或组成，转化率，阶段产率，车间总产率等。

8.2.3.2 转化率

对某一组分A来说，生成产物所消耗掉的物料量与投入反应物料量之比简称该组分的转化率，一般以百分率表示。若用符号JA表示组分的转化率，则得：

8.2.3.3 收率(产率)

某主要产物实际产量与投入原料计算的理论产量之比值，也以百分率表示。用符号Y表示，则得：

收率一般要说明是按哪一种主要原料计算得到的。

8.2.3.4 选择性

各种主、副产物中，主产物所占比率或百分率可用符号φ表示，则得：

实际测得的转化率、收率和选择性等数据将作为设计工业反应器的依据，同时这些数据是评价这套生产装置效果优劣的重要指标。

8.2.3.5 车间总收率

一个化学合成药物的生产过程由若于物理及化学反应工序组成，车间总收率与各工序收率的关系为：

在计算收率时，必须注意质量监控，即对各工序中间体和药品纯度要有质量分析数据。

8.2.4 物料衡算的计算步骤

(1)收集和计算所必需的基本数据；

(2)列出化学反应方程式，包括主反应和副反应；根据给定条件画出工艺流程简图；

(3)选择物料衡算计算的基难；

(4)进行物料衡算；

(5)列出物料衡算表：①输入与输出的物料衡算表；②“三废”排放量表；③计算原辅材料消耗定额，通常按生产1kg产品计算。

在化学合成药物的工艺研究中，特别要注意成品的质量标准、原辅材料的质量和规格，各工序中间体的质量监控方法以及回收品的处理等，这些都是影响物料衡算的因素。表8－2为一中药厂某车间主要物料衡算表。

表8－2 某中药生产车间主要物料衡算表

8.3 能量衡算

8.3.1 能量衡算的理论基础

制药生产过程中包含有化学过程和物理过程，往往伴随着能量变化，因此必须进行能量衡算。又因生产中一般无轴功存在或轴功相对来讲影响较小，因此能量衡算实质上是热量衡算。

热量衡算的主要依据是能量守恒定律。在无轴功的条件下，进入系统的热量与离开系统的热量相互平衡。

其热量衡算表达式为：

式中 Q1──物料进入设备带到设备中的热量；

Q2──由加热剂 (冷却剂)传给设备和物料的热量(加热时取正值，冷却时取负值)；

Q3──过程的热效应，它分为两类，即化学反应热效应和状态变化热效应；

Q4──物料从设备离开所带走的热量；

Q5──消耗于加热 (冷却)设备和各个部件上的热量；

Q6──设备向四周散失的热量。

通过上式可以计算出Q2，由Q2进而可计算加热剂或冷却剂的消耗量。

8.3.2 计算过程

(1)所处理的物料带到设备中去的热量Q1，可用下式计算：

式中 G——物料的重量(kg)；

c——物料的比热容(kJ／kg•℃)；

t——物料的温度(℃)。

G 的数值根据物料衡算的结果而定。t的数值由生产工艺操作规程或中间试验数据或由其他搜集得来的资料而定。至于物料的比热容可从各种手册中找到，在缺乏数据的情况下可根据经验式或做实验求取。

(2)由加热剂(或冷却剂)传给设备和所处理的物料之热量Q2，在大多数情况下为未知

数，需利用热量衡算来求出。据此用以确定传热面积的大小，以及加热剂(或冷却剂)的用量。

(3)过程的热效应Q3，可以分成两类，一类是由于发生化学反应的结果，放出或吸入的热量，一般称为化学反应热。另一类是由于物理——化学过程所引起的结果。此种热量一般称为状态热。

在某一过程中，有时只有化学反应热，有时只有状态热，有时两者兼有。

属化学反应热的有聚合热、硝化热、磺化热、氯化热、氧化热、氢化热、中和热等等。这些化学反应热的数据可以从手册、工艺学书籍、工厂实际生产数据、中间试验数据，以及科学研究中获得。如果缺乏数据，可根据元素的生成热和化合物的燃烧热求以出。

属状态热的有汽化热、熔融热、溶解热、升华热、结晶热等等。这些数据同样也可从手册、化工过程及化工计算书籍等资料来源中找到。

(4)反应产物由设备中带出的热量Q4，计算方法同所处理的物料带到设备中去的热量Q1。

(5)消耗在加热设备各个部件上的热量Q5。

应该指出，对于连续操作的设备只需建立物料平衡和热量平衡，不需要建立时间平衡。但对于间歇操作的设备，还需建立时间平衡。这是因为在间歇操作中，条件随时间而改变。

设计工作中技术经济分析的任务是对整个工厂基建投资的经济效果、综合性技术经济指标，进行分析和论证，作出评价的结论。并把各项技术经济指标和结论与国内外现有同类型的先进指标进行对比，以此说明本设计的先进性和不足，求得基建投资费最有效的利用。

8.4 工艺经济性评价

设计工作的技术经济分析的主要内容有以下几项：

(1)基建投资的经济分析；

(2)产品设计成本(或经营费用)的经济分析；

(3)劳动生产率的分析；

(4)投产府财务效益分析等等。

技术经济分析—般采用对比分折法对设计方案的经济效果进行分析和论证，从中优选设计方案。其程序如下：

(1)依据设计任务书的要求，深入调查研究，掌握资料数据，提出几种可能对比的设计方案。

(2)全面论述每一可能方案的优缺点，初步确定两个拟比的较好的方案。

(3)计算两个较好方案的技术经济指标，对比分析其综合经济效果，最后选定最优方案。

8.4.1 产品成本的经济分析

产品成本是由可变的费用与不变的费用来构成的。前者通称为变动成本，后者通称为固定成本。其表达式为：

产品成本＝变动成本十固定成本

其中，变动成本指项目费用因素中的原料、辅料、燃料及动力(水、电、汽等)消耗等，随企业年产量(t／a)增加或降低而有增减变化；而固定成本为工人工资及附加费、车间经费、企业管理费等项。

8.4.2 基建投资费用的经济分析

基建投资费用有投资总额，也有投资单位费用。后者是投资总额分摊到单位产品(或单位生产能力)的投资费用。

一般情况下，投资总额较大而生产效率较高的方案，有可能是经济合理的方案。在分析基建投资时，除对方案本身的投资数量进行分析，尚需对投资费用的构成项目，如厂房建筑费、设备购置费、设备安装工程费以及其他费用等，进行分析，比较各项投资费用占投资总额的百分数，以便找出采取降低投资费用的相应措施。

8.4.3 技术经济效果综合分析

技术经济效果综合分析的目的，在于完成年产量的前提下，选出一个投资省、周期短、见效快的最佳设计方案。上述经济分析，仅仅是投资费用和产品成本这两个指标的综合分析。实际上还有一些经济指标，比如投资回收期、投资利润率、成本利润率、年销售收益比率、内部收益率等指标，用以评价设计方案的经济效果和反映设计技术水平。

9.1 概述

生物反应器是指一个能为生物反应提供适宜的反应条件，以实现将原料转化为特定产品的设备，是生物技术产业化的核心。

生物反应器设计的主要内容包括：（1）反应器选型，即根据生产工艺要求、反应及物料的特性等因素，确定反应器的操作方式、结构类型、传递和流动方式等；（2）设计反应器结构，确定各种结构参数，即确定反应器的内部结构及几何尺寸、搅拌器形式、大小及转速、换热方式及换热面积等；（3）确定工艺参数及其控制方式，如温度、压力、pH、通气量、底物浓度、进料的浓度、流量和温度等。

生物反应器设计的基本要求：

（1） 避免将必须蒸汽灭菌的部件与其它部件直接相连；

（2） 法兰应尽量少；

（3） 尽可能采用焊接连接，焊接部位要充分抛光；

（4） 避免产生凹陷和裂缝；

（5） 设备各部件能分别进行灭菌；

（6） 反应器的接口处用蒸汽封口；

（7） 阀门要易清洗，易使用，易灭菌；

（8） 反应器内易保持一定正压；

（9） 为便于清洗，反应器主体部分应尽量简单。

反应器的设计以及工程放大，主要采用数学模型法，即利用数学模型来分析、研究生化反应过程中的现象和规律，即用数学语言表达过程中各种变量之间的关系。

数学模型的建立：以生物反应器为研究对象，将其中的生化反应过程分解为生化反应、传递过程及流体流动与混合等子过程，并分别进行研究，通过物料衡算和热量衡算将各子过程的相关参数进行关联和偶合，即对动力学方程、物料衡算及热量衡算式联立求解，从而得到所研究的生化反应过程规律的解析表达形式。

另一方面，由于生化反应过程极为复杂，往往对过程的机理研究得不透彻或有些问题尚不清楚，在这种情况下，就必须结合一定的经验模型，即在一定条件下由实验数据进行数学关联并拟合而得到的模型。

9.2反应器的分类和结构特点

由于生物催化剂种类和生产目的的多样性，生物反应器种类繁多。不同的生物反应器在结构和操作方式上具有不同的特点。根据生物反应器的结构和操作方式的某些特征，可以从不同角度对其进行分类。

9.2.1根据反应器的操作方式分类

根据反应器的操作方式不同，可将生物反应器分为间歇式生物反应器、连续式生物反应器和半连续式（流加）生物反应器。

间歇式反应器，其基本特征是：反应物料一次性加入、一次性卸出，反应器内物系的组成仅随时间而变化，属于一种非稳态过程。间歇式反应器适用于多品种、小批量、反应速率较慢的反应过程，可以经常进行灭菌操作。在实际应用中，由于间歇培养不会产生严重的染菌问题、因周期短而较适合于遗传变异性大的细胞、对过程控制的要求较低、能适应培养细胞株和产物经常变化的需要，因此是应用最广泛的操作模式。

采用连续操作的反应器被称为连续式反应器，这一操作方式的特点是原料连续流入反应器，反应产物则连续从反应器流出。反应器内任何部位的物系组成均不随时间变化，故属于稳态操作。连续操作反应器一般具有产品质量稳定、生产效率高等优点，因而适合于大批量生产。

半间歇半连续操作系指原料与产物只有其中一种为连续输入或输出，而其余则为分批加入或输出的操作，相应的反应器称为半连续式反应器或流加式反应器。半连续操作同时兼有间歇操作和连续操作某些特点的操作。

9.2.2根据催化剂分类

生物催化剂包括酶和细胞两大类，相应地，生物反应器也可以分为酶反应器和细胞反应器。

酶催化反应与一般的化学反应并无本质的区别，催化剂本身不会因为反应而增加，但是酶催化反应的条件更加温和。酶催化反应器的结构往往与化学反应器类似，且通常不需要太高的温度和压力。游离酶催化常采用搅拌罐反应器，固定化酶催化除了搅拌罐反应器外，常选择固定床反应器，近年来，酶膜反应器的应用正在日益增多。

细胞培养过程是典型的自催化过程，细胞本身既是催化剂，同时又是反应的主要产物之一。因此，催化剂的量是随反应的进行而不断增大的。对于这种活的催化剂，在反应过程中保持细胞的生长和代谢活性是对反应器设计的最基本要求。

根据细胞类型的不同，细胞反应器又可分为微生物细胞反应器（通常称为发酵罐）、动物细胞反应器和植物细胞反应器。根据不同类型细胞的生理特点，对反应器也有不同的要求。例如，动植物细胞是好氧的，同时对剪切力又非常敏感，在设计反应器时如何在氧传递和剪切力之间的矛盾找到一个平衡点就成为要考虑的首要问题；植物细胞培养可能需要可见光，就要采用光生物反应器。

9.2.3根据流体流动或混合状况分类

对于连续反应器，有两种理想的流动模型：一种是反应器内的流体在各个方向完全混合均匀，称为全混流（CSTR），其主要特征是反应物加入到反应器中，同时反应产物也离开反应器，并保持反应体积不变，其过程是一物系中组成不随时间改变的定态过程；

另一种则是通过反应器的所有物料以相同的方向、速度向前推进，在流体流动方向上完全不混合，而在垂直于流动方向的截面上则完全混合，所有微元体在反应器中所停留的时间都是相同的，这种流动模型称为平推流、活塞流或柱塞流（PFR）。

实际反应器内流体的流动方式则往往介于上述两种理想流动模型之间，称为非理想流动（混合）模型。非理想生物反应器需要考虑流动和混合的非理想性，如：流体在连续操作反应器中的停留时间分布、微混合问题、反应器轴向或径向扩（弥）散及反应器操作的震荡问题等。间歇操作的非理想生物反应器则需要考虑混合时间、剪切力分布、各组分浓度及温度分布等复杂问题。

9.2.4根据反应器结构特征及动力输入方式分类

根据反应器的主要结构特征（如外形和内部结构）的不同，可以将其分为釜（罐）式、管式、塔式、膜式反应器等，它们之间的差别主要反映在其外形（长径比）和内部结构上的不同。釜式生物反应器能用于间歇、流加和连续所有三种操作模式，而管式、塔式和生物膜反应器等则一般适用于连续操作的细胞反应工程。

根据动力输入方式的不同，生物反应器可以分为机械搅拌反应器、气流搅拌反应器和液体环流反应器。机械搅拌反应器采用机械搅拌实现反应体系的混合（图9-1）。气流搅拌反应器以压缩空气作为动力来源（图9-2）。而液体环流反应器则通过外部的液体循环泵实现动力输入（图9-3）。

图9-1机械搅拌反应器

（G — 气体；L — 液体；M — 电机）

图9-2气流搅拌反应器

（G — 气体；L — 液体）

图9-3液体环流反应器

9.3 发酵罐设计与分析

9.3.1 通气搅拌罐的结构特征

通气搅拌罐是好氧生物反应器的典型代表，其主要组成部分有壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等。

反应器主体采用不锈钢材料，通常采用涡轮式搅拌器。搅拌轴与罐体的连接要进行无菌密封。罐体底部设有空气分布器或喷嘴，通过空气过滤器的无菌空气从孔径几毫米的多孔管鼓入培养液内。搅拌器由置于罐顶的搅拌电机以一定的转速驱动旋转，通过搅拌涡轮产生的液体漩涡及剪切力，将鼓入的空气打碎成小气泡，并均匀分散在培养液中。这样，既提供了细胞生长所需氧，同时又使培养液浓度均匀。反应器的装料系数一般为70～80％。系统通常还设有消泡装置、参数测试元件、蛇管或夹套冷却装置等。典型通气搅拌罐的一些基本特征可以参考图9-4。

图9-4 通气搅拌罐的典型结构及尺寸

通气搅拌罐适用于大多数的生物工程，它具有以下优点：pH值及温度易于控制；工业放大方法研究比较多；适合连续培养。不足之处是：搅拌消耗的功率较大；结构比较复杂，难以彻底拆卸清洗，易染菌；剪切力稍大，特别是培养丝状菌体时，对细胞有较大损伤，等等。

经过半个多世纪的发展，现在通气搅拌罐的几何尺寸都趋向于标准化，表9.1列举了通气搅拌罐一些主要相对尺寸的范围。

表9-1通气搅拌罐的一些主要相对尺寸的范围

相对尺寸 符号 范围 典型值

罐体的高径比 H/D 1～3

搅拌桨直径与罐体直径之比 Di/D 1/3～1/2 1/3(Rushton桨)

挡板宽度与罐体直径之比 Wb/D 1/8～1/12（4块挡板） 1/10

最下层搅拌桨高度与罐体直径之比 0.8～1.0

相邻两层搅拌桨距离与搅拌桨直径之比 1～2.5

9.3.2 机械搅拌系统

作为通气搅拌罐的主要特征之一，机械搅拌系统提供的动力是机械搅拌罐质量传递、热量传递、混合和悬浮物均匀分布的基本保证。搅拌装置的设计和选择必须综合考虑以满足上述要求并降低造价和动力消耗。

机械搅拌系统由电机、变速箱、搅拌轴、搅拌桨、轴封和挡板组成。下面做简要的介绍。

1．电机和变速箱

电机和变速箱置于罐体之外。对小型反应器，可以采用单相电驱动的电机，而大型反应器所用的一般均为三相电机。对大型反应器，由于电机的转速一般远高于搅拌转速，必须通过变速箱降低转速。实验室小型反应器可以采用无级变速，不需要变速箱。在间歇培养时，细胞生长各个阶段对剪切力和氧传递有不同的要求，为了降低功耗，最好采用可调速电机。

2．搅拌轴

搅拌轴既可以从顶部伸入罐体，也可以从底部伸入罐体，前者称为上搅拌，后者称为下搅拌。一般而言，上搅拌的制造和安装成本要略高于下搅拌。但是，采用下搅拌时，培养基中的固体颗粒或者可溶性成分在水分挥发后形成的结晶会损坏轴封，使其维护成本增加。不同尺寸的通气搅拌罐，其搅拌桨层数也不同，小型通气搅拌罐一般只有一层搅拌桨，而大型通气搅拌罐一般具有2～4层搅拌桨以改善混合和传质。

3．轴封

轴封的主要作用是防止环境中的微生物侵入反应器以及培养液等发生泄漏。机械传动部件往往是造成染菌的主要原因之一，因此轴封设计的关键是避免染菌和泄漏，应尽可能采用无菌密封材料。

4．挡板

为防止搅拌时液面上产生大的旋涡，并促进罐内流体在各个方向的混合，与搅拌桨相对应，在罐体上还安装有挡板。挡板的设计要满足“全挡板条件”。所谓全挡板条件，是指在搅拌罐中再增加挡板或其它附件时，搅拌功率不再增加。挡板的数目通常为4～6块，其宽度为0.1～0.12D。全挡板条件是达到消除液面漩涡的最低条件。在一定的转速下面增加罐内附件而轴功率保持不变。此条件与挡板数Z，挡板宽度W和罐径D有关，必须满足下面的关系式

（9-1）

式中 W—— 挡板宽度， m；

D—— 罐内径， m；

Z—— 挡板数。

5．搅拌桨

根据搅拌所产生的流体运动的初始方向，可以将搅拌桨分为径向流搅拌桨和轴向流搅拌桨（图9-5）。径向流搅拌桨将流体向外推进，遇反应器内壁和档板后再向上下两侧折返，产生次生流（图9-6a）。轴向流搅拌桨则使流体一开始就沿轴向运动（图9-6b）。一般而言，带轴向流搅拌桨的反应器，其功率准数较低，达到同样混合效果所需消耗的能量要远低于径向流搅拌桨。径向流搅拌桨所造成的剪切力大于轴向流搅拌桨，这有利于打碎气泡，从而增大总括氧传递速率常数，但会对有些细胞产生伤害。因此，径向流搅拌桨多用于对剪切力不敏感的好氧细菌和酵母的培养，而轴向流搅拌桨多用于对剪切力敏感的生物反应体系。对于大型发酵罐，可采用这两类搅拌桨混合配置的设计，以充分发挥各自的优点。最下层的桨一般采用平板桨，这种桨具有优良的气泡破碎效果，这是在青霉素发酵研究和开发中得到的经验，一直沿用至今。

六直叶圆盘涡轮搅拌器(Rushton桨) 六弯叶圆盘涡轮搅拌器 三叶后掠式搅拌器

径向流搅拌浆

推进式搅拌器 四折叶开启涡轮搅拌器 六折叶圆盘涡轮搅拌器

轴向流搅拌浆

图9-5 径向流搅拌桨和轴向流搅拌桨示例

a轴向流 b径向流

图9-6 轴向流和径向流示意图

9.3.3 反应器的搅拌功率

搅拌功率的大小对流体的混合、气液固三相间的质量传递一级反应器的热量传递都有很多的影响。因此，生物反应器搅拌功率的确定对于反应器的设计是相当重要的。

1．不通气条件下的搅拌功率计算

在机械搅拌发酵罐中，搅拌器的输出功率P0(W)与下列因素有关：发酵罐直径D（m）、搅拌器直径d（m）、液面高度HL（m）、搅拌器的转速N（r/s）、液体黏度μ（Pa•s）、流体密度ρ(kg/m3)、重力加速度g（m/s2）以及搅拌器形式和结构等。通过量纲分析及实验证实，对于牛顿型流体而言，可以得到下列准数关联式：

（9-2）

式中

——功率准数；

——搅拌情况下的雷诺数；

——搅拌下的弗鲁特数；

K——与搅拌器类型、发酵罐几何尺寸有关的常数。

从而上式又可改写为

（9-3）

实验证实，在全挡板条件下，液面未出现漩涡，此时指数y＝0，上式可简化为 ，即搅拌准数Np式搅拌雷诺数ReM的函数。

2．通气条件下的搅拌功率计算

当发酵罐通入压缩空气后，搅拌器的轴功率与不通气时相比会有所下降，减小的程度与通气量相关。可能的原因有：通气使得液体密度下降；通气使得液体发生翻动。为了计算通气条件下的搅拌功率，必须引入通气准数Na，它表示发酵罐内空气的表观流速与搅拌叶顶端流速之比，即

（9-4）

式中

Qg —— 工况通气量，m3/s；

d —— 搅拌桨直径，m；

N —— 搅拌转速，r/s

用Pg表示通气条件下的搅拌功率，P0为不通气时的搅拌功率，则

当Na ＜0.035时， （9-5）

当Na ≥0.035时， （9-6）

3．非牛顿流体特性对搅拌功率计算的影响

通常将不服从牛顿黏性定律的流体称为非牛顿流体，非牛顿流体的剪应力与切变率不成正比关系，因而非牛顿流体没有确定的粘度值。常见的非牛顿流体可分为三类。

① 拟塑性流体 其剪应力与剪切率的关系满足

（9-7）

式中

k —— 均匀性系数，也称稠度指数；

n —— 流动性指数，n＜1。

大多数发酵液都属于这种类型。特点是随着k增大，流体就越黏，n值越小，流体的非牛顿性越明显。

② 彬汉塑性流体 其特点是剪应力与剪切率的关系是不通过原点的直线。

（9-8）

式中

—— 屈服剪应力；

—— 刚性系数

③ 涨塑性流体

（9-9）

式中

k —— 均匀性系数

n —— 流动性指数，n＞1。

对于非牛顿型流体搅拌功率的计算与牛顿型流体搅拌功率的计算方法一样，可用 的关系式进行计算。但这类流体的黏度是随搅拌速度甚至发酵时间而变化的，因而必须事先知道发酵液黏度与它们的关系，然后才能计算不同条件下的ReM。但从大量的实验数据中可以看出，牛顿型流体和非牛顿型流体的Np－ReM曲线基本吻合，仅在ReM =10～300区间之内存在较大的差别，因此，在计算当中可直接按照牛顿型流体进行搅拌功率的计算。

9.3.4 通气系统

通气系统由无菌空气制备系统、空气分布装置和出口气体除菌系统组成。无菌空气制备系统是一套相对独立的复杂系统，这里不做介绍。

细胞生长和代谢所需的无菌空气通过空气分布管引入罐中。空气分布管一般位于最下层的搅拌桨的正下方。为保证气泡的分散，多采用带小孔的环状空气分布管，环的直径一般等于搅拌桨的直径。在大型通气搅拌罐中，搅拌桨尖附近的剪切力非常大，一般足以达到充分打碎气泡的目的，为防止培养液中的固体物料或菌丝堵塞空气分布管，对某些特殊的发酵体系有时采用向下开口的单孔管。

在一些简单的反应器中，气体的排出只是通过一个简单的阀门控制的。为避免染菌，必须调节空气的排出阀以保证反应器内始终处于高于大气压的正压状态。一些精密的反应器则配备了出口气体冷凝装置和过滤装置

9.3.5 温度控制系统

为了保证为细胞生长和代谢提供合适的温度，温度控制系统也是通气搅拌罐所必备的。温度控制系统由温度测量电极、热交换装置及相应的控制装置组成。

由于生物反应和机械搅拌都是放热过程，多数生物反应体系在运行期间需要冷却，就地灭菌后的培养基更要求快速泠却。对大型通气搅拌罐，通常采用罐内安装的冷却盘管或采用夹套式发酵罐进行温度控制；而对5m3以下的小型通气搅拌罐，热交换器多采用夹套作为换热装置。对大型反应器，盘管的冷却效率要远高于夹套，而且传热面积可以根据需要设计，但它要占用反应器空间，并使反应器清洗和灭菌更加困难。为了强化传热，夹套可以设计成蜂窝状以增加冷却介质的流速，这样可以弥补传热面积不足的限制。

培养基的就地灭菌需要加热装置。有时细胞培养的开始阶段和结束阶段由于细胞产生的代谢热不足以维持生物反应器内的最适温度，需要通过热交换器加热。大型反应器培养基的就地灭菌一般采用直接向反应器中通入高压水蒸汽的方法实现快速加热。小型反应器则通常采用夹套加热或电加热。

9.3.6 pH值和溶氧测量与控制系统

细胞生长都有最适pH值，因此需要对培养介质的pH进行检测和控制。

pH控制系统包括pH电极、酸及碱储罐、耐酸或碱的管道和泵及相应的控制系统组成。根据不同生物反应体系的实际需要，可以只加酸或加碱系统，也可以两者都具备。在流加培养时，通过碳源或/和氮源的补料也能起到调节pH的作用。

溶氧是好氧发酵体系最重要的参数之一。传统的工业发酵罐只是简单地通过人工调节空气流量来实现溶氧控制，可灭菌的溶氧电极改变了这种情况，使溶解氧浓度也可以实现在线检测和控制，为及时了解发酵过程的进程及提高产物产量创造了条件。有些先进的发酵罐还配备了发酵罐尾气分析装置，可在线分析尾气中的氧及二氧化碳浓度，以协助判断发酵的过程的正常与否，对发酵动力学及代谢流分析等都很有帮助。有些发酵过程是微好氧过程，要求反应体系保持很低的溶氧值；还有一些高好氧过程的氧消耗速率很快，造成发酵液中的溶解氧浓度很低，这些过低的溶氧值都可能是溶氧电极无法精确测量的。这种情况就需要安装氧化还原电极以检测细胞培养的正常与否。

9.3.7 消泡系统

消泡系统对好氧发酵过程是非常重要的。通气搅拌罐的装液量一般不能超过容器容积的70～80％，一方面，这是由于通气后液面会有所上升；更重要的原因是，预留部分空间可以避免泡沫马上冲出罐体，为消除泡沫提供一段缓冲的时间。一般对越容易产生泡沫的体系，装液量要越少。图9-4中，通气搅拌罐顶部有一个额外的搅拌桨，称为消泡桨，其作用就是通过机械作用消除泡沫。在多数情况下，仅凭消泡桨还不足以及时破坏所有的泡沫，因此通常还须进一步采用添加化学消泡剂的方法消泡。

植物油、聚醚类非离子型表面活性剂都可以用于化学消泡，它们可以直接在配制在培养基中，也可以在发酵过程中根据需要加入，或者两种策略同时使用。为了及时检测泡沫是否达到预警高度，通常在反应器上方装有液位电极，一旦泡沫达到相应的高度，就可以通过消泡控制装置自动向反应器中流加消泡剂。

9.5 其他反应器

9.5.1鼓泡塔生物反应器

鼓泡塔生物反应器（Bubble tower bioreactor），又称鼓泡柱生物反应器（Bubble column bioreactor），是最简单的气流搅拌生物反应器。鼓泡塔生物反应器的罐体为一个较高的柱形容器，气体作为分散相由反应器底部的气体分布器进入，以气流的动力实现反应体系的混合（图9-7）。

图9-7鼓泡塔生物反应器

与机械搅拌式反应器相比，鼓泡塔生物反应器的主要优点是：反应器结构简单，易于操作，操作成本低；内无转动设备，能耗较低，反应器中的剪切力也较小；由于避免了轴封，对保持无菌条件有利。因此，鼓泡塔生物反应器比较适合于那些对剪切力敏感、而且容易染菌的细胞培养体系，如某些微生物发酵、动物细胞培养和植物细胞培养等。但是，由于鼓泡塔生物反应器缺乏控制流体运动的措施，其混合和氧传递效率较低，为达到一定的混合和氧传递效果，鼓泡塔生物反应器通常采用高于通气搅拌罐的通气量，且其高径比也较大。多数鼓泡塔反应器的高径比在8:1到20:1之间。较高的高径比使鼓泡塔反应器具有较高的气含率和较长的气体停留时间，也使其底部的空气分布装置处具有较高的静水压，这些都在一定程度上有利于提高氧传递效率。目前，鼓泡塔反应器被广泛应用于生物工程行业中，例如乙醇发酵、单细胞蛋白发酵、废水处理、废气处理等。

9.5.2气升式生物反应器

气升式生物反应器（Airlift loop bioreactor）是应用最为广泛的生物反应器之一。它是在鼓泡塔的基础上发展起来的，它利用气体的喷射功能和流体密度差造成反应液循环流动，并通过安装导流筒（Draft tube）来增强反应器内的传递效果和强化流体的循环流动。

气升式反应器的导流筒有多种类型，按其采取的液体循环方式不同可以将其分为内循环气升式环流反应器（图9-8a）和外循环气升式环流反应器（图9-8b）两类。其中以内循环气升式环流反应器最为常见，其优点是结构简单、设备制造比较容易。气体既可以从内置导流筒内部通入，也可以从其外侧通入，两种情况下上行区和下行区刚好相反（图9-9）。反应器顶部是气体脱离反应体系的区域，因而称为脱离区。有些气升式反应器顶部脱离区的直径要大于主罐体的直径，目的是降低该区域的流体运动速率，给气泡脱离以充分的时间，避免或减少富含二氧化碳的气泡通过下行区循环回反应器；另外，这也有助于减少因形成气雾而损失培养基，并可减少泡沫的产生。

a. 内循环气升式生物环流反应器 b.外循环气升式生物环流反应器

图9-8气升式生物反应器（G为气体分布器）

气升式生物反应器的气体分布装置也可采用喷嘴（图9-10）。为了提高氧传递效率，可利用喷嘴口及其附近高速运动的流体产生强剪切力来减小气泡尺寸，该类反应器称为气升式喷射环流生物反应器。喷嘴的设计方式多种多样，但其基本原理均一致，图9-11给出了不同样式的喷嘴设计形式。

气升式生物反应器除具有鼓泡塔生物反应器的优点外，还具有反应溶液分布均匀、高的溶氧速率和溶氧效率、剪切应力小、传热良好等优点。同时，它要求的通气量和通气压力较高，使空气净化工段的负荷增加，对于黏度较大的培养液，溶解氧系数较低。另外，操作弹性小，低气速在高密度培养时，其混合效果较差。通气量提高会导致泡沫产生。

图9-9 上行区、下行区和脱离区

（G为气体，L为液体，F表示流量）

图9-10采用喷嘴的气升式生物反应器

（G为气体，F为循环流体）

图9-11气升式生物反应器的几种喷嘴设计方案

影响气升式生物反应器的主要结构和操作参数有：气含率、气液比、循环周期与循环速度、通气功率等。

（1） 气含率

气含率是气升式生物反应器的一个主要参数。在含有导流筒的内循环气升式生物反应器中，气含率定义为

平均体积气含率 （9.12）

导流筒内（上升区域）气含率 （9.13）

环隙内（下降区域）气含率 （9.14）

局部气含率 （9.15）

（2）循环周期与循环速度

循环周期指液体微元在反应器内循环一周所需要的平均时间，即平均循环时间。循环周期一般在2.5～4min之间。循环周期 可用下式进行计算：

（9.16）

式中

——循环周期，s；

——发酵液体积，m3；

——发酵液环流量，m3/s；

w ——发酵液在环流管内流速，m/s；

d ——环流罐内径，m。

（3）气液比

气液比是指发酵液的环流量QC与通风量Q之比：

（9.17）

式中

Q——通风量，m3/s。

（4）通气功率 PG

气升式生物反应器的通气功率可用下式进行计算：

（9.18）

式中

——发酵液密度，kg/m3；

g —— 重力加速度，m/s2；

H —— 气体分布器距液面高度，m；

Q——通风量，m3/s。

一般来说，在相同条件下，通气功率越大，供氧速率越大，供氧功率因数越小。

9.5.3固定床生物反应器

固定床生物反应器（Fixed bed bioreactor）是由连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂组成，另外，也可以由连续不动的气体和静止不动的固体底物和微生物组成。根据反应器中液相流动方式的差别，可以将常见的固定床生物反应器分为两种：一为填充床生物反应器，一为涓流床生物反应器。

填充床生物反应器（Packed bed bioreactor）可以是垂直的，也可以是水平的（图9-12）。垂直的填充床生物反应器比较常见，反应器中流体通常从底部进入反应器，从顶部流出，细胞固定于支持物表面或内部,支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。填充床中单位体积细胞较多，由于混合效果不好常使床内氧的传递、气体的派出、温度和pH的控制困难；另外一个困难就是床层容易被小颗粒或以破碎的颗粒堵塞，流体流动困难，床层阻力增大。

图9-12 填充床生物反应器

填充床生物反应器在固定化酶催化反应体系中比较常见，下面的讨论中将忽略反应器轴向弥散的影响，液体流动方式假设可以用理想的平推流来描述。由于固定化反应器的一部分空间被生物催化剂的固体颗粒占据，在分析动力学行为前必须先引入空隙率的概念。空隙率ε定义为：

(9-19)

式中

VS —— 反应器中空隙体积，m3；

VT —— 反应器中固体的真实体积，m3；

VR —— 反应器总体积，m3。

若反应器总体积为V，长度为L，流体的流量为F，则反应器中液体的实际流速为：

(9-20)

由此可以求出流体在反应器中的停留时间τ，

(9-21)

在选择固定化细胞反应器时，传质是重要的考虑因素。填充床生物反应器的传质状况较差，一般只适合于固定化非生长细胞或厌氧的固定化生长细胞。对固定化非生长细胞，因为不需要供应氧，一般也不需要移去气态CO2，操作相对比较方便。对厌氧的生长细胞，虽然不需要通空气，但反应过程中必须及时地将代谢产生的CO2移出反应器，为此可以考虑采用水平放置的填充床，在反应器上方给发酵产生的CO2留出适当的空间，以便在不夹带液体的情况下将气体排出。

9.5.4流化床生物反应器

流化床生物反应器（Fluidized bed bioreactor）是通过流态化（Fluidization）来强化固体颗粒与流体相之间混合、传质和传热的反应装置。实现流态化的能量是输入反应器的流体所携带的动能，这种流体既可以是液体，也可以是气体，或者两者皆是。

与固定床生物反应器相比，流化床生物反应器能提供更好的混合、传质及传热效果和最小的反应器压降。另外，流化床生物反应器还具有以下优点：

1） 由于流体混合更加均匀，反应器中的pH、溶氧、温度等参数的检测和控制更加容易；

2） 固相组成在轴向的差异性较小，便于取样和分析；

3） 不易发生阻塞，因而可以采用尺寸更小、比表面积更大的固定化载体颗粒，从而为细胞的固定化提供更大的表面积。

从应用角度看，上述这些特性对反应器的可操作性是至关重要的。

在生物反应体系中，常见的流化床生物反应器为又可分为液—固两相流化床生物反应器和气—液—固三相流化床生物反应器（图9-13），前者用于厌氧生物反应体系（由于厌氧发酵会回产生气体，实际上也是一个三相体系），而后者多用于好氧过程。

图9-13 流化床生物反应器

要使固体粒子处于流化状态是需要消耗能量的，只有当流体流速大于最小流化速度时粒子才能流化。好在固定化细胞的载体材料（如海藻酸钙、纤维等）密度较小，所要求的最小流化速度也比较小。流体的流速与反应过程的转化率直接相关，达到流态化所需的流量往往要超过根据反应动力学和目标转化率确定的操作流量。在这种情况下，为了同时保证合适的转化率和达到流态化，对液—固两相流化床生物反应器通常都利用外部的液体循环泵进行反应液的循环以期达到流态化所需的流量。对气—液—固三相流化床生物反应器，是否需要采用额外的液体循环系统取决于过量的通气是否会对细胞生长产生负面影响，以及通气和液体循环之间的成本比较。

流化床的基本参数包括床层流化速度、颗粒的带出速度、操作速度、流化数以及床层的膨胀比等，下面分别做一些介绍。

（1） 流化速度Umf

当流体流过颗粒床层的阻力等于床层颗粒重力时，床层中的颗粒就开始流动起来，此时的流体称作床层的流化速度，记作Umf。它仅与流体和颗粒的物性有关。具有代表性的计算公式有：

对于 ＜20的小颗粒， (9-22)

对于 ＞1000的大颗粒，(9-23)

式中

dp —— 颗粒的平均粒径，m；

、 ——气体和颗粒的密度，kg/m3；

—— 气体的黏度，Pa•s；

g —— 重力加速度，m/s2。

（2） 颗粒的带出速度Ut

如果床内流体的速度等于颗粒在流体中的自由沉降速度时，颗粒开始从床内流出，此时流体的速度称为颗粒的带出速度，记做Ut。

当 ＜0.4时，(9-24)

当0.4＜ ＜500时，(9-25)

当 ＞500时，(9-26)

（3） 操作速度U0和流化数ω

操作速度U0即表示流化床在正常操作时流体的速度，一般Umf＜U0＜Ut。而流化数ω表示操作速度与起始流化速度之比，即ω＝U0 /Umf，对于一般的流化床，ω＝1.5～10，但对于有些流化床ω可以达到几十甚至几百。流化床操作速度U0大小选择原则是：当过程为效应不大，反应速度慢，催化剂颗粒小，筛分宽，床内无内部构件和要求催化剂带出量少的情况，宜采用较低的气速，反之，则采用较高的气速。

床层的膨胀比R为床层正常流化时床层高度Hf与床层处于其实流化态时的床层高度Hmf之比，即(9-27)

式中

ε、 ——床层的空隙率、密度；

下标mf、f——起始流化、正常流化状态。

对于粗颗粒床（dp＞100 m），R≈1.1～1.2

对于细颗粒床（dp＜100 m），R≈1.2～1.7

流化床生物反应器的设计

（1） 床径DT的确定

当生产能力，即单位时间内反应器的体积流量V给定后，根据工程特点选定流化数ω或操作速度U0，则床层的壳体直径DT可以由下式给出： (9-28)

即 (9-29)

（2） 床层流化高度Hf的确定

正常流化床的床高 ,其中， 为床层起始流化床状态时的床层高度，R为床层的膨胀比。

（3） 扩大段直径D的确定

如果颗粒回收需要在床层上部加扩大段作为自由沉降段，则其直径D由最大颗粒的带出速度Ut决定，即 (9-30)

10.1 中试放大的概念与内容

10.1.1 中试放大的概念

由原料到成品之间的各个相互连接的单元操作过程及其质量监控是生产工艺过程，一个产品由若干个车间线完成生产。由具有直接关系的单元操作的次序、条件组成了工艺过程，辅助过程包括动力供应、原料供应、包装、储运、三废处理等。将实验室和中试车间试验取得的研究结果应用到大规模的工业生产中的过程就是放大（Scale up）。工艺的放大包括实验室、中试工厂（车间）和生产车间3个步骤。

制药工艺过程的开发研究包括以下内容：

（1）实验室小试：在实验室规模的条件下进行，研究化学或生物合成反应步骤及其规律，考查工艺参数、设备与原料，转化率，收率，成本估算等。目的是为中试做技术准备。要求收率稳定，质量可靠。确定操作条件，制成品、半成品、中间品、原料等建立相应的分析方法。

（2）中试放大：把实验室小试研究确定的工艺路线与条件，放大50－100倍的中等规模，进行工艺试验，工业化生产考查、优化，包括产品质量、经济效益、劳动强度等，确定最佳操作条件。目的是为车间设计、施工安装、中间质控，制定质量要求与规程提供数据和资料。

（3）制定生产工艺：在大型设备和车间投入生产，试制若干批号后，制定出生产工艺规程。

10.1.2 中试放大内容

中试放大的内容是研究在一定规模设备中的操作参数和条件的变化规律，验证实验室工艺路线的可行性，解决在实验室阶段未能解决或尚未发现的问题。

1、验证工艺路线，修正工艺过程，确定生产工艺流程。

2、工艺条件限度实验与过程优化控制。

3、原辅料和中间体质量控制。

10.2 中试放大研究的基本方法

10.2.1 经验放大

经验放大是根据已有的操作经验，所建立的一些规律，通过摸索反应器的特征，从实验室装置到中试装置、再到车间大型装置，实现逐级放大。这些规律大多是半定性的，是简单和粗放的定量。经验放大是基于空时得率相等的原则，即虽然反应规模不同，但单位时间、单位体积反应器所生产的产品量(或处理的原料量)是相同的，通过物料平衡，求出为完成规定的生产任务所需处理的原料量后，得到空时得串的经验数据，即可求得放大反应所需反应器的容积。经验放大的原则有：

1、几何相似放大。按反应器各部件的几何尺寸比例进行放大，放大倍数是实际反应器体积的倍数。当体积放大10倍时，反应器的高度和直径均放大 倍。

2、恒定等体积搅拌功率放大，是一般化学反应器的放大准则。

3、恒定体积氧传质系数放大。

4、恒定空气线速度放大。

5、恒定体积的空气流量放大。

6、恒定搅拌器叶尖速度放大。

7、恒定混合时间放大。

采用经验放大法的前提条件是放大的反应装置必须与提供经验数据的装置保持完全相同的操作条件。经验放大法适用于反应器的搅拌形式、结构等反应条件相似的情况，而且放大倍数不宜过大。由于化学合成药物生产中化学反应复杂，原料与中间体种类繁多，化学动力学方面的研究往往又不够充分，因此难于从理论上精确地对反应器进行计算。反应器的放大问题还没有解决，主要采用经验放大。据统计，实际放大过程中应用最多的是体积氧传质系数相同的放大。

10.2.2 相似模拟放大

根据相似理论，保持无因次准数（相似准数）相等的原则进行放大。基于对过程的了解，确定影响因素，用因次分析求得相似准数，根据相似理论的第一定律，系统相似时同一相似准数的数值相同，计算后，进行放大。已成功应用于各种物理过程，但化学反应过程和生化反应有一定困难。在反应器中，反应与流体流动、传热及传质过程交织在一起，要同时保持几何相似、流体力学相似、传热相似、传质相似相反应相似是不可能的。

10.2.3 数学模拟放大

数学模拟放大是用数学方程式表述实际过程和实验结果，然后计算机模拟研究、设计，放大。建立数学模型的方法有导师型、无导师型和混合型。影响反应的因素复杂，不可能用数学方程全面、定量描述过程的真实情况。一般地，先对过程进行合理简化，提出物理模型，模拟实际过程。再对物理模型进行数学描述，从而得到数学模型。对数学模型，在计算机上研究各参数的变化对过程的影响。数学模拟放大法以过程参数间的定量关系为基础，能进行高倍数放大，缩短放大周期。

数学模拟进行工程放大，主要取决于预测大设备的行为的数学模型的可靠性。比较分析模型计算结果与中试放大或生产设备的数据，对模型进行修正，可提高数学模型的可靠性。精确的模拟需要大量的基础研究工作，过程参数的定量关系等，因此在实际应用有效的事例并不多见，但代表着放大的发展方向。

10.3 中试放大的研究

10.3.1 原料的特点

生物材料本身成分复杂，除多糖、蛋白质、核酸、脂类等高分子化合物外，还有糖蛋白等复合物。生物技术药物的含量较低，存在异构体等。对于基因工程技术生产的蛋白质药物，其活性与结构和构象有密切关系。空间构象的破坏往往导致药物失活。维持空间结构的次级键对酸、碱、有机试剂、重金属、热、光等因素敏感。所处的环境和介质影响其结构，生产中的机械剪切力、金属器壁的摩擦力、传热传质等过程不仅会影响细胞的活性与功能，也影响药物的活性。生产条件的变化对质量影响大，在工艺放大过程中应严格监测质量的动态变化，在分离纯化等过程必须采用措施防止变性失活。生物技术药物具有低稳定性，易受物理化学和生物因素的影响而变性失去活性。细胞破碎后，打破了原有的亚细胞布局，不再存在细胞隔室，药物失去了空间保护。一旦提取出来后，离体的药物，容易受到理化因素的攻击，变性失去活性。与化学药物不同，生物技术药物生产过程可能产生热源（pyrogen）和过敏原(allergen)。

10.3.2 中试放大的装置

中试放大采用的装置，根据反应类型、操作条件等选择和设计，要考虑对材质和型式的要求，特别是接触腐蚀性物料，并按照工艺流程进行安装。可用微型中间装置取代大型中间装置，为工业化装置提供精确的设计数据。在一般情况下，不必全工艺流程的中试放大，以关键环节就可以中试放大。中试放大也可以在适应性很强的多功能车间中进行，无需按生产流程来布置生产设备，对样品制备或进行小批量试制，适合多种产品的中试放大。

制药是在反应器内进行的，无论离体还是在体反应器，各类设备都是进行现代制药工艺、实现最终产品必不可缺的硬件。对于药物生产领域，不同的生物来源的药物，其原料（即生物细胞）的培养、处理和药物的制造过程都有较大的区别。要求设备是智能化、全自动化、密闭、在线实时检测，尽可能减少人为操作因素，保证质量的稳定、可控，生产高效率。生物技术制药的规模，一方面追求提高反应器体积，目前搅拌罐反应器的体积已达到500M3，而单细胞蛋白反应器达2000M3。另一方面，如单克隆抗体等免疫与诊断试剂，却在实验室规模生产制造就能满足需要。在某些药物的制造中，反应器成为其大规模生产的限制因素。

10.3.3 操作方法

在中试放大阶段，根据物料的处理量和类型，应考虑反应与后处理的操作方法与工业化规模相适应，缩短工序，简化操作。减轻劳动强度，尽可能自动化操作和输送，良好的安全工作环境和工作条件。

药物的结构和组成决定着其性质，各种理化和生物条件均能影响其活性，综合考虑这些因素以及工程因素，合理设计生产工艺路线，研制高效表达的载体及宿主系统，研制生物反应器并优化培养条件，研制经济适用的高效分离纯化方法及设备，自动化监控质量过程等，对细胞进行大规模培养，从而制造目标药物。

10.3.4 生产工艺规程

产品介绍：名称（商品名、化学名、英文名），化学结构、分子式、分子量，规格，理化性质，质量标准及检验方法，药理作用，毒副作用，用途、适应症和用法、包装和贮存。

反应过程：主反应、副反应、辅助反应，终点控制。

生产工艺流程：以反应为中心，图解物理化学过程。

设备表：岗位，名称，规格，数量，体积和性能，材质，动力。

设备使用：使用方法和注意事项。

原辅料和中间体及其质量标准：规格，名称（商品名、化学名、英文名），化学结构、分子式、分子量，理化性质，质量标准及检验方法，注意事项。

生产工艺过程：反应介质，工艺操作，工艺条件和注意事项，终点控制，异常现象及其处理。

操作工时与生产周期：岗位与工序，操作时间，生产时间，辅助操作时间，生产总周期。

生产经济指标：生产能力，成品和副产品，收率；生产率和成本；原辅料等消耗。

技术安全：易燃、易爆、有毒物料及其容器操作的防火、防爆的预防原则与技术措施，注意事项。